藏黨參提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的影響及機(jī)制研究

趙靜 郭睿博 羅布占堆 丁亞麗 普珍 董海 謝紅軍

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）08-0967-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.12

摘 要 目的：研究藏黨參提取物（以下簡(jiǎn)稱“ZDS”）對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠的影響及機(jī)制。方法：在48只大鼠中隨機(jī)選8只作為正常對(duì)照組（生理鹽水），剩余40只大鼠建立CIA模型。造模成功后，將其隨機(jī)分為模型組（生理鹽水），ZDS低、中、高劑量組（0.44、0.88、1.76 g/kg，以生藥量計(jì)）和地塞米松組（陽(yáng)性對(duì)照，0.002 5 g/kg），每組8只。灌胃給藥，灌胃體積為400 μL，每天1次，連續(xù)28天。分別于給藥前（0天）及給藥7、14、21、28天后稱定大鼠體質(zhì)量，并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分;末次給藥后，觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化，測(cè)定其胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、血清中炎癥因子[白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6]水平以及膝關(guān)節(jié)滑膜組織中核因子κB（NF-κB） p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、磷酸化IκB（p-IκB）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量（給藥14、21、28天）顯著降低（P<0.05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分（給藥前及給藥不同時(shí)間）顯著升高（P<0.05），關(guān)節(jié)滑膜組織病理?yè)p傷明顯，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、炎癥因子水平以及p-NF-κB p65、p-IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），IκB蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，ZDS低劑量組大鼠IL-1β水平顯著降低（P<0.05）;ZDS中、高劑量組和地塞米松組大鼠的體質(zhì)量（給藥21、28天）均顯著增加（P<0.05），關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分（給藥14、21、28天）均顯著降低（P<0.05），關(guān)節(jié)滑膜組織病理?yè)p傷明顯減輕，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、炎癥因子水平以及p-NF-κB p65、p-IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：ZDS對(duì)CIA模型大鼠具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;藏黨參;提取物;膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎;核因子κB信號(hào)通路;大鼠

Effects of Tibetan Codonopsis tralictrifolia Extract on Collagen-induced Arthritis Model Rats and Its Mechanism Study

ZHAO Jing1，GUO Ruibo2，Luobuzhandui1，DING Yali1，PU Zhen1，DONG Hai1，XIE Hongjun1（1. Medical College， Tibet University， Lhasa 850000， China; 2. School of Pharmacy， Liaoning University of TCM， Liaoning Dalian 116600， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Tibetan Codonopsis tralictrifolia extract （called “ZDS” for short） on collagen-induced arthritis （CIA） model rats and its mechanism. METHODS： Eight of 48 rats were randomly selected as normal control group （normal saline）， and the remaining 40 rats were used to establish CIA model. After successful modeling， the rats were randomly divided into model group （normal saline）， ZDS low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.44， 0.88， 1.76? ?g/kg， by crude drug）， dexamethasone group （positive control， 0.002 5 g/kg）， with 8 rats in each group. They were given relevant medicine intragastrically， the volume of 400 μL， once a day， for consecutive 28 days. The body weight of rats were weighed before medication （0 d）， 7， 14， 21 and 28 days after medication; and arthritis indexes were scored. The pathological changes of the knee joint synoviual tissue were observed after last medication. The thymus index， spleen index， the levels of serum inflammatory factors （IL-1β， TNF-α， IL-6）， protein expressions of NF-κB p65， p-NF-κB p65， IκB and p-IκB in synovial tissue were detected. RESULTS： Compared with normal control group， the body weight （14， 21， 28 days after administration） of rats in model group was significantly reduced （P<0.05）; the arthritis index score （before administration and different administration time） was significantly increased （P<0.05）; the joint synovial tissue was pathologically damaged; the thymus and spleen index， inflammation factor level， the protein expression of p-NF-κB p65 and p-IκB were increased significantly （P<0.05）， while the protein expression of IκB was decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the level of IL-1β was decreased significantly in ZDS low-dose group （P<0.05）. Body weight of rats （21， 28 days after administration） were increased significantly in ZDS medium-dose and high-dose groups， dexamethasone group （P<0.05）， while arthritis index score （14， 21， 28 days after administration） was decreased significantly （P<0.05）. The pathological damage of joint synovial tissue was significantly relieved; thymus and spleen index， inflammation factor level， the protein expression of p-NF-κB p65 and p-IκB were significantly reduced， while the protein expression of IκB was significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： ZDS can improve CIA model rats to some extent， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway.

KEYWORDS? ?Rheumatoid arthritis; Codonopsis tralictrifolia; Extract; Collagen-induced arthritis; NF-κB signaling pathway; Rat

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見(jiàn)的慢性、炎癥性、系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)及其組織非化膿性炎癥為主要特征，終致關(guān)節(jié)的各種組織以及多臟器損害[1]。RA的基本病理特征為關(guān)節(jié)慢性滑膜炎、滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管翳的形成，以及可侵及下層的軟骨或骨，可造成關(guān)節(jié)破壞甚至功能喪失[2-3]。RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及機(jī)體的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中核因子κB（NF-κB）被認(rèn)為是重要的炎癥信號(hào)通路，對(duì)RA的發(fā)生與發(fā)展具有核心的調(diào)節(jié)作用[4]。目前，臨床主要用于治療RA的藥物包括非甾體抗炎藥、抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素類和生物制劑類藥物，這些藥物雖可緩解疾病癥狀，但不能控制病情的進(jìn)展，且其除了消化道、腎臟和心血管系統(tǒng)副作用外，還可引發(fā)感染、免疫缺陷、高血糖癥等不良反應(yīng)，不宜長(zhǎng)時(shí)間使用[5]。

藏黨參始載于《晶珠本草》，為桔?？浦参镩L(zhǎng)花黨參Codonopsis thalictrifolia Wall. var. mollis Chipp.的全草，其味苦、辛、澀，性涼，具有消炎散腫、祛風(fēng)除濕等功效，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、瘡癤痛腫、麻風(fēng)病等[6-7]。藏黨參的主要活性成分包括生物堿、酚性物質(zhì)、揮發(fā)油、有機(jī)酸、甾醇和三萜類化合物[8]。有研究表明，以藏黨參為主藥的羅堆多吉顆粒可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性而降低血尿酸水平，從而起到治療痛風(fēng)的作用[9]。此外，藏黨參還是藏醫(yī)藥中治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)腫痛的要藥[10]，但其活性成分及作用機(jī)制尚未十分明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，藏黨參乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠具有明顯的改善作用。基于此，本研究擬通過(guò)建立CIA大鼠模型，從NF-κB信號(hào)通路角度探討藏黨參提取物治療RA的可能作用機(jī)制，為闡明藏黨參對(duì)RA的療效及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Ti-S型熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司;RM2235型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;HBS-1096A型酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;Mini-Sub Cell GT Cell型Western blot電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;4100型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

藏黨參飲片（批號(hào)201902411）購(gòu)自西藏白薩工貿(mào)有限公司，經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院藏藥研究所扎西次仁教授鑒定為真品;地塞米松注射液（批號(hào)2006031，規(guī)格1 mL ∶ 2 mg）購(gòu)自西安高科陜西金方藥業(yè)公司;雞Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑（批號(hào)分別為SLBT1422、SLBT1714、SLBV4134）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)MB9898Oct- 23D）購(gòu)自大連美侖生物有限公司;白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒和總蛋白提取試劑盒（批號(hào)分別為20200512、20200516、20200601、20190816）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;兔源NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制蛋白（IκB）、磷酸化IκB（p-IκB）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（貨號(hào)分別為bs-23216R、bs-3485R、bs-10246R、bs-2513R、bsm-0978M）均購(gòu)自北京博奧森生物有限公司;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)2019001004）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批號(hào)121017200621）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD大鼠48只，雌雄各半，5～6周齡，體質(zhì)量140～170 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（遼）2020-0001。大鼠購(gòu)入后分籠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，實(shí)驗(yàn)室溫度為20～25 ℃、相對(duì)濕度為55%～65%，飼養(yǎng)期間自由飲水、攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究中所有實(shí)驗(yàn)方案均得到了遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 藏黨參提取物的制備

稱取藏黨參飲片300 g，粉碎，過(guò)40目篩，以10倍量（mL/g）30%乙醇浸泡60 min，隨后加熱回流提取2次，每次2 h;濾過(guò)，合并2次濾液，減壓回收溶劑，得浸膏78.42 g，得率為26.14%。將浸膏用等量乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，減壓回收溶劑，得浸膏19.50 g。將浸膏用水溶解制成終質(zhì)量濃度為1.0 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，置于4 ℃冰箱中保存。臨用時(shí)取出，用水稀釋成不同質(zhì)量濃度的藥液。

2.2 分組、造模與給藥

取雞Ⅱ型膠原20 mg溶于0.1 mol/L乙酸溶液10 mL中，使前者終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，于4 ℃下以磁力攪拌器攪拌過(guò)夜，使膠原充分溶解。次日，于4 ℃下將上述膠原溶液逐滴滴加至等體積的弗氏完全佐劑中（邊滴加邊攪拌，直到乳化至油包水狀態(tài)，且以在水中不擴(kuò)散為宜），將此作為初次免疫乳化劑;由弗氏不完全佐劑替換弗氏完全佐劑制備繼發(fā)免疫乳化劑，制備步驟同前。在48只大鼠中隨機(jī)選8只作為正常對(duì)照組（雌雄各半）;剩余40只大鼠先在尾根部皮下單次注射初次免疫乳化劑100 μL，初次免疫7天后，再于每只大鼠尾根部皮下單次注射繼發(fā)免疫乳化劑100 μL，以建立CIA模型[11];正常對(duì)照組大鼠同步注射無(wú)菌生理鹽水。利用大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分（標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)“2.3”項(xiàng)下）評(píng)價(jià)造模情況：4個(gè)關(guān)節(jié)評(píng)分相加，累積評(píng)分≥4分則表示CIA模型制備成功[12]。

將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組，黨參提取物低、中、高劑量組（0.44、0.88、1.76 g/kg，以生藥量計(jì)）和地塞米松組（陽(yáng)性對(duì)照，0.002 5 g/kg），每組8只（雌雄各半）。地塞米松組大鼠給藥劑量根據(jù)成人（體質(zhì)量70 kg）臨床用量按人與大鼠體質(zhì)量系數(shù)換算后得到;藏黨參提取物低、中、高劑量分別根據(jù)成人（70 kg）藏黨參臨床用量（10 g）按人與大鼠體質(zhì)量系數(shù)換算后得到，分別為成人臨床給藥量的1、2、4倍。各給藥組大鼠均灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積400 μL，每天1次，連續(xù)28天;正常對(duì)照組和模型組大鼠同步灌胃等體積生理鹽水。

2.3 大鼠體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分測(cè)定

分別于給藥前（記為0天）和給藥7、14、21、28天后稱定各組大鼠體質(zhì)量，并對(duì)其左后足關(guān)節(jié)進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分為關(guān)節(jié)無(wú)腫脹;1分為關(guān)節(jié)輕微腫脹;2分為關(guān)節(jié)中度腫脹;3分為關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹;4分為關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫脹并影響運(yùn)動(dòng)[11]。本指標(biāo)評(píng)判由3人完成，并取平均值作為最終評(píng)分結(jié)果。

2.4 樣本采集及處理

末次給藥1 h后，將各組大鼠麻醉，于腹主動(dòng)脈采血，然后以3 000 r/min離心5 min，吸取上層血清，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。取血后，沿大鼠膝關(guān)節(jié)正中切開(kāi)皮膚，暴露膝關(guān)節(jié)中心，提起髕骨，剝離完整的膝關(guān)節(jié)滑膜組織。將一部分滑膜組織置于脫鈣液中進(jìn)行脫鈣處理，用于HE染色;另一部分置于-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白檢測(cè)。完整摘取大鼠胸腺和脾臟，以生理鹽水漂洗，用濾紙吸干多余水分后，稱定質(zhì)量，用于計(jì)算胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。

2.5 大鼠滑膜組織病理變化觀察

將經(jīng)脫鈣處理后的大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，隨后分別用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并進(jìn)行常規(guī)石蠟切片（厚度約為4 μm），行常規(guī)HE染色，并置于顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜組織病理變化情況。

2.6 大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定

取大鼠胸腺和脾臟，根據(jù)如下公式計(jì)算其胸腺指數(shù)和脾指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）;脾指數(shù)=脾質(zhì)量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

2.7 大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6水平測(cè)定

取大鼠血清適量，采用ELISA法以酶標(biāo)儀測(cè)定各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作。

2.8 大鼠滑膜組織中NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western blot法進(jìn)行測(cè)定。取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，勻漿后，采用總蛋白提取試劑盒提取組織中的總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白變性常規(guī)加熱變性后，取20 μg于100 V電壓下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳60 min，然后在300 mA恒流下轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜2 h，用5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h;加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB、GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;以TBST溶液洗滌5 min×3次，加入二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），室溫孵育1 h。以TBST溶液洗滌5 min×3次，用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色后，置于凝膠成像儀上成像。用Image J v1.8.0軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠體質(zhì)量的影響

給藥前（0天），各組大鼠的體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠在給藥14、21、28天后的體質(zhì)量均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠在給藥21、28天后的體質(zhì)量均顯著升高（P<0.05），但藏黨參提取物低劑量組大鼠在給藥不同時(shí)間后的體質(zhì)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠給藥前和給藥不同時(shí)間后的體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分在給藥前（0天）和給藥不同時(shí)間后均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠在給藥14、21、28天后的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均顯著降低（P<0.05），但藏黨參提取物低劑量組大鼠在給藥前和給藥不同時(shí)間后的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠給藥前和給藥不同時(shí)間后的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理?yè)p傷的影響

正常對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞排列緊湊、整齊，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生、呈5～6層分布，可見(jiàn)大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藏黨參提取物低劑量組與模型組大鼠膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)類似，可見(jiàn)膝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增生以及大量單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn);藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠的滑膜病理?yè)p傷均有不同程度改善，表現(xiàn)為滑膜增生減輕、表面較光滑、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少等，其中以藏黨參提取物高劑量組和地塞米松組大鼠的改善較為明顯。各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HE染色顯微圖見(jiàn)圖1（圖中，箭頭所指為炎性細(xì)胞）。

3.4 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均顯著降低（P<0.05），但藏黨參提取物低劑量組大鼠上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3.5 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β水平以及藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平均顯著降低（P<0.05），但藏黨參提取物低劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-6水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

3.6 藏黨參提取物對(duì)CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中p-NF-κB p65、p-IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），而IκB蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，藏黨參提取物中、高劑量組和地塞米松組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中p-NF-κB p65、p-IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），而IκB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;但各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平以及藏黨參提取物低劑量組大鼠滑膜組織中p-NF-κB p65、IκB、p-IκB蛋白的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中NF- κB p65、p-NF-κB p65、IκB、p-IκB蛋白表達(dá)的電泳圖見(jiàn)圖2，表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

4 討論

RA在藏醫(yī)中被稱為“真布”“痹癥”?！端牟酷t(yī)典》中記載，“因緣濕腴境與油膩食，未轉(zhuǎn)輕未熟黃水盛，黃水成駐于骨肉筋腱生濕痹”，故藏醫(yī)認(rèn)為RA是由于長(zhǎng)期暴露于潮濕、寒涼之地，或長(zhǎng)期食用油膩之飲食及心理創(chuàng)傷、外傷等其他因素導(dǎo)致胃火衰竭、精華不化、清濁不分，使機(jī)體代謝失常，引起未成熟的黃水偏盛而浸駐于骨肉關(guān)節(jié)所導(dǎo)致的[13-14]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA屬于慢性、全身性、自身免疫性疾病，其主要臨床表現(xiàn)包括進(jìn)行性、對(duì)稱性以及侵蝕性的外周關(guān)節(jié)破壞等，該癥可侵襲全身多個(gè)關(guān)節(jié)，出現(xiàn)增生性滑膜炎，破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[15]。CIA模型是一種免疫性炎癥模型，表現(xiàn)為多發(fā)性末端關(guān)節(jié)炎[16]。Ⅱ型膠原蛋白存在于哺乳動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨中，但當(dāng)其作為外源性抗原侵入機(jī)體時(shí)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Ⅱ型膠原蛋白抗體，而該抗體可通過(guò)與軟骨結(jié)合后激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎性質(zhì)的自身免疫反應(yīng)，且此免疫反應(yīng)可持續(xù)發(fā)展，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、滑膜增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞及全身性炎癥反應(yīng)等癥狀，與人類RA的臨床癥狀相似，故CIA模型是研究RA發(fā)生發(fā)展以及篩選治療藥物的理想動(dòng)物模型[17]。地塞米松屬于糖皮質(zhì)激素類藥物，具有強(qiáng)大的抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛用于自身免疫系統(tǒng)疾病、過(guò)敏性疾病及炎癥性疾病的治療[18]。美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)曾將地塞米松等糖皮質(zhì)激素類藥物作為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的首選藥物[19]。因此，本研究選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，一些免疫抑制劑可使胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低，而免疫增強(qiáng)劑可使胸腺指數(shù)和脾指數(shù)升高，因此胸腺指數(shù)、脾指數(shù)是觀察藥物對(duì)免疫功能影響的重要指標(biāo)之一[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分以及胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均顯著升高，說(shuō)明模型大鼠的免疫系統(tǒng)處于異常狀態(tài);給予中、高劑量的藏黨參提取物后，模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分及胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均顯著降低，說(shuō)明藏黨參提取物改善了CIA模型大鼠的免疫異常。此外，CIA病變過(guò)程與淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞的過(guò)度活化和增殖有關(guān)，這些細(xì)胞可大量釋放炎癥因子，從而引起炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[21]。TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子在CIA的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其釋放量增加可加重炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并破壞關(guān)節(jié)組織[22]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量藏黨參提取物能夠顯著改善CIA模型大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理?yè)p傷、降低其血清中炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平，說(shuō)明藏黨參提取物可抑制CIA模型大鼠的炎癥反應(yīng)。

NF-κB信號(hào)通路與CIA炎癥反應(yīng)的關(guān)系非常密切[23]。靜息狀態(tài)下，NF-κB p50與p65形成的異源二聚體和IκB結(jié)合，形成NF-κB-IκB復(fù)合物，該復(fù)合物以無(wú)活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到上游信號(hào)刺激后，IκB發(fā)生磷酸化從復(fù)合物中解離出來(lái)并發(fā)生降解，使NF-κB p65發(fā)生磷酸化而激活。激活的NF-κB p65會(huì)暴露核定位序列，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)，與特定位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)大量炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）的生成并釋放，引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和關(guān)節(jié)滑膜的損傷[24]。有研究表明，RA患者和動(dòng)物模型中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平均顯著升高[25]。因此，NF-κB通路已經(jīng)成為RA治療藥物研發(fā)的主要靶點(diǎn)之一，通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路活性，可減少炎癥因子的誘導(dǎo)與生成，從而減輕RA的炎癥反應(yīng)[26-28]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量藏黨參提取物可顯著降低CIA模型大鼠滑膜組織中p-NF-κB p65、p-IκB蛋白的表達(dá)水平，顯著升高IκB蛋白的表達(dá)水平，而無(wú)活性的NF-κB p65蛋白的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明藏黨參提取物改善CIA的作用機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，藏黨參提取物能夠增加CIA模型大鼠體質(zhì)量，降低其關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，改善其關(guān)節(jié)滑膜病理?yè)p傷，降低其胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及血清中炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平，其作用可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但其發(fā)揮RA治療作用的具體活性物質(zhì)及更多作用機(jī)制仍需進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] NAIR N，PLANT D，VERSTAPPEN S M，et al. Differential DNA methylation correlates with response to methotrexate in rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology（Oxford），2020，59（6）：1364-1371.

[ 2 ] ITOH Y. Metalloproteinases in rheumatoid arthritis：potential therapeutic targets to improve current therapies[J]. Prog Mol Biol Transl Sci，2017，148：327-338.

[ 3 ] MARTIN G V，KANAAN S B，HEMON M F，et al. Mosai- cism of XX and XXY cells accounts for high copy number of Toll like receptor 7 and 8 genes in peripheral blood of men with rheumatoid arthritis[J]. Sci Rep，2019，9（1）：12880.

[ 4 ] 閆慧明，張雪，安燕，等.分子信號(hào)通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].風(fēng)濕病與關(guān)節(jié)炎，2020，9（9）：76-80.

[ 5 ] 磨紅，馬宗伯，吳成龍.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療研究進(jìn)展[J].內(nèi)科，2017，12（3）：334-337.

[ 6 ] 羅達(dá)尚.新秀晶珠本草[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2004：134-136.

[ 7 ] 楊永昌.藏藥志[M].西寧：青海人民出版社，1991：65-66.

[ 8 ] 孫杰，聶麗娟，郭桅，等.藏黨參對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響[J].西藏醫(yī)藥，2015，36（2）：11-13.

[ 9 ] 卓瑪東智，孫杰，袁瑞瑛，等.羅堆多吉顆粒及組方成分陸額對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響研究[J].西藏大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，30（1）：58-62.

[10] 孫杰.藏藥陸額對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的影響及其化學(xué)成分研究[D].拉薩：西藏大學(xué)，2016.

[11] 馮悅，鐘萌，羅見(jiàn)春，等. 18F-FDG PET/CT技術(shù)監(jiān)測(cè)雷公藤甲素對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)損傷的改善作用[J].中國(guó)藥房，2018，29（22）：3059-3062.

[12] 劉青，萬(wàn)碧江.針刀治療膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜組織Bcl-2/Bax的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2021，25（5）：729-734.

[13] 卓瑪措.藏醫(yī)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病理機(jī)制探討[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2016，22（8）：45-46.

[14] 王靜，趙可惠，更藏加，等.藏醫(yī)真布病與中醫(yī)痹癥的對(duì)比探討[J].世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（10）：2167-2171.

[15] MOLLARD E，MICHAUD K. Mobile apps for rheumatoid arthritis：opportunities and challenges[J]. Rheum Dis Clin North Am，2019，45（2）：197-209.

[16] 于坤，徐枝芳，余楠楠，等.佐劑性和膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型比較分析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（1）：106-109.

[17] CHOUDHARY N，BHATT L K，PRABHAVALKAR K S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis[J].Immunopharmacol Immunotoxicol，2018，40（3）：193-200.

[18] HAJIALILO M，GHORBANIHAGHIO A，VALAEE L，? et al. A double-blind randomized comparative study of? ?triamcinolone hexacetonide and dexamethasone intra-? ? articular injection for the treatment of knee joint arthritis in rheumatoid arthritis[J]. Clin Rheumatol，2016，35（12）：2887-2891.

[19] JINAGAL J，GUPTA G，AGARWAL A，et al. Safety and efficacy of dexamethasone implant along with phacoemulsification and intraocular lens implantation in children with juvenile idiopathic arthritis associated uveitis[J]. Indian J Ophthalmol，2019，67（1）：69-74.

[20] SU J，LI Q，LIU J，et al. Ethyl acetate extract of Tibetan medicine rhamnella gilgitica ameliorated type II collagen-induced arthritis in rats via regulating JAK-STAT signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol，2021，267：113514.

[21] DA FONSECA L J S，NUNES-SOUZA V，GOULART? ?M O F，et al. Oxidative stress in rheumatoid arthritis：what the future might hold regarding novel biomarkers and add-on therapies[J]. Oxid Med Cell Longev，2019，2019：7536805.

[22] ZHENG Y，SUN L，JIANG T，et al. TNFα promotes Th17 cell differentiation through IL-6 and IL-1β produced by monocytes in rheumatoid arthritis[J]. J Immunol Res，2014，2014：385352.

[23] LI G，XIA Z，LIU Y，et al. SIRT1 inhibits rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte aggressiveness and inflammatory response via suppressing NF-κB pathway[J].Biosci Rep，2018，38（3）：BSR 20180541.

[24] KARWASRA R，SINGH S，SHARMA D，et al. Pomegra- nate supplementation attenuates inflammation，joint dysfunction via inhibition of NF-κB signaling pathway in experimental models of rheumatoid arthritis[J]. J Food Biochem，2019，43（8）：e12959.

[25] TIAN R，LI X，LI Y，et al. 1，25（OH）D promotes chondrocyte apoptosis and restores physical function in rheumatoid arthritis through the NF-κB signal pathway[J].Biomed Pharmacother，2018， 106：149-155.

[26] HONG H，ZENG Y，JIAN W，et al. CDK7 inhibition suppresses rheumatoid arthritis inflammation via blockage of NF-κB activation and IL-1β/IL-6 secretion[J]. J Cell Mol Med，2018，222（2）：1-10.

[27] PENG S，HU C，LIU X，et al. Rhoifolin regulates oxidative stress and proinflammatory cytokine levels in Freunds adjuvant-induced rheumatoid arthritis via inhibition of NF-κB[J]. Braz J Med Biol Res，2020，53（6）：e9489.

[28] XIA Z B，YUAN Y J，ZHANG Q H，et al. Salvianolic acid B suppresses inflammatory mediator levels by downregulating NF-κB in a rat model of rheumatoid arthritis[J].Med Sci Monit，2018，24：2524-2532.

（收稿日期：2020-12-04 修回日期：2021-02-03）

（編輯：林 靜）