金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠的抗炎作用及機制研究

付志麗 蒲健 李龔路 譚丹 鄭林 李勇軍 黃勇

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）09-1077-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.09.09

摘 要 目的：研究金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠的抗炎作用及機制。方法：將48只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、金骨蓮膠囊低、中、高劑量組（0.66、1.32、2.64 g/kg）和地塞米松組（陽性對照，0.945 mg/kg），每組8只?？瞻讓φ战M和模型組大鼠灌胃等體積水，其余各組大鼠灌胃相應藥物，每天給藥2次，連續(xù)3 天。末次給藥后30 min，模型組和給藥組大鼠腹腔注射脂多糖（10 mg/kg）以復制炎癥模型。腹腔注射6 h后，于大鼠尾靜脈取血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、前列腺素E2（PGE2）的含量;測定大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值;采用蘇木精-伊紅染色法觀察大鼠肺組織的病理學形態(tài)變化;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應法檢測大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、PGE2、IL-1β mRNA的表達水平;采用Western blot法檢測大鼠肺組織中核因子κB（NF-κB）p65蛋白的磷酸化水平和NF-κB抑制蛋白α（IκBα）蛋白的表達水平。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量，肺組織W/D比值，肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2 mRNA的表達水平和NF-κB p65蛋白磷酸化水平均顯著升高，IκBα蛋白表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01）;大鼠肺組織中大量肺泡萎縮塌陷、壁增厚，可見肺實質(zhì)化及大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，金骨蓮膠囊各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β（低劑量組除外）、IL-6、PGE2的含量，以及肺組織中TNF-α（低劑量組除外）、IL-1β、IL-6（低、高劑量組除外）、PGE2 mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;金骨蓮膠囊高劑量組大鼠肺組織W/D比值顯著降低（P<0.05或P<0.01）;金骨蓮膠囊中劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白磷酸化水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），IκBα蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）;大鼠肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰、壁輕度增厚，并見少量炎癥細胞浸潤。結(jié)論：金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠具有良好的抗炎作用，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 金骨蓮膠囊;抗炎作用;炎癥因子;核因子κB信號通路

Study on Anti-inflammatory Effect and Mechanism of Jingulian Capsule on Inflammatory Model Rats

FU Zhili1，2，3，PU Jian4，LI Gonglu1，3，TAN Dan4，ZHENG Lin1，LI Yongjun1，HUANG Yong1（1. Guizhou Provincial Key Labortary of Pharmaceutics/National Key Labortay of Efficacy and Utilization of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. Dept. of Pharmaceutics， Guizhou Nursing Vocational College， Guiyang 551300， China; 3. College of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 4. Guizhou Yibai Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the anti-inflammatory effect and mechanism of Jingulian capsule on inflammatory model rats. METHODS： Totally 48 rats were randomly divided into blank control group， model group， Jingulian capsule low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.66， 1.32， 2.64 g/kg）， dexamethasone group （positive control， 0.945 mg/kg）， with 8 rats in each group. Blank control group and model group were given constant volume of water intragastrically， and other groups were given relevant medicine intragastrocally， twice a day， for consecutive 3 days. Thirty minutes after last administration， model group and administration groups were given lipopolysaccharide （10 mg/kg） intraperitoneally to induce inflammatory model. Six hours after intraperitoneal injection， the contents of TNF-α， IL-1β， IL-6， PGE2 in serum were detected by ELISA. The wet to dry weight （W/D） ratio of lung tissue were determined. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. RT-PCR was used to detect the mRNA expression of TNF-α， IL-6， PGE2 and IL-1β in lung tissue. Western blot assay was used to detect the phosphorylation of NF-κB p65 protein and the expression of? ? IκBα protein in lung tissue. RESULTS： Compared with blank control group， the contents of TNF-α， IL-1β， IL-6 and PGE2 in serum， the W/D ratio of lung tissue， the expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and PGE2 mRNA and the phosphorylation level of NF-κB p65 protein in lung tissue of model group were significantly increased， and the expression of IκBα protein was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）; a large number of alveolar atrophy and collapse， alveolar wall thickening， lung consolidation， and a large number of inflammatory cell infiltration could be seen in lung tissue. Compared with model group， the contents of TNF-α， IL-1β （except for low-dose group）， IL-6 and PGE2 in serum， as well as the expression of TNF-α （except for high-dose group）， IL-1β， IL-6 （except for low-dose， high-dose groups） and PGE2 mRNA in lung tissue were decreased significantly in Jingulian capsule groups （P<0.05 or P<0.01）; the W/D ratio of lung tissue was decreased significantly in Jingulian high-dose group （P<0.05 or P<0.01）; the expression of phosphorylation level of NF-κB p65 protein in lung tissue of Jingulian medium-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， while the expression of IκBα protein was increased significantly （P<0.05）; the alveolar structure was clear， the alveolar wall was slightly thickened， and a small amount of inflammatory cell infiltration was seen in lung tissue. CONCLUSIONS： Jingulian capsule has good anti-inflammatory effect on inflammatory model rats， the mechanism of which may be related to the inhibition of NF-κB signal pathway.

KEYWORDS? ?Jingulian capsule; Anti-inflammatory effect; Inflammatory cytokines; NF-κB signal pathway

炎癥是機體對損傷因子產(chǎn)生的正常防御反應，機體很多疾病均與炎癥有關(guān)[1]，如風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、肺炎等，嚴重的炎癥會導致多器官衰竭、危及生命[2-3]。目前，治療炎癥的主要有非甾體類、糖皮質(zhì)激素類藥物，但這類藥物的不良反應較多，不適宜長期使用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥在治療炎癥方面具有療效較好、毒副作用小等優(yōu)點[5]。因此，開發(fā)抗炎類中藥對臨床治療炎癥具有重要意義。

金骨蓮膠囊源于經(jīng)典苗藥組方，具有祛風除濕、消腫止痛的功效，為治療風濕痹證的苗藥獨家品種，收載于《國家中成藥標準匯編》[6]和《國家基本醫(yī)療保險和工傷保險藥品目錄》[7]。金骨蓮膠囊由大血藤、八角楓、透骨香、漢桃葉和金鐵鎖組方而成，其組方藥味含有大血藤素、八角楓總堿、漢桃葉有機酸等多種抗炎活性成分[8]。金骨蓮膠囊前期基礎(chǔ)研究薄弱，其研究主要集中于臨床應用方面，如治療風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、急性軟組織損傷等[9-10]，但其抗炎作用機制尚不明確。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，炎癥的產(chǎn)生與多種炎癥介質(zhì)的失控性釋放有關(guān)，這些炎癥介質(zhì)的釋放主要受到核因子κB（NF-κB）調(diào)節(jié)[11]。NF-κB是一種存在于真核細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起到關(guān)鍵性作用[12]。在結(jié)構(gòu)上，NF-κB是一個二聚體，在活化的細胞中最常見的NF-κB二聚體形式是NF-κB p65或p50。正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκBα結(jié)合，以無活性的三聚體形式存在于細胞漿中[13];當細胞受到外界信號的激活時，NF-κB與IκBα發(fā)生解離并活化，活化的NF-κB迅速從細胞漿轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并與相應基因上的κB位點結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄程序，引起腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、前列腺素E2（PGE2）等炎癥因子釋放，造成炎癥級聯(lián)放大反應[14]?；诖耍狙芯坎捎酶骨蛔⑸渲嗵牵↙PS）制備炎癥模型大鼠[15]，通過測定大鼠血清中TNF-α等相關(guān)炎癥因子的水平、肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量（W/D）比值，觀察大鼠肺組織的病理學形態(tài)變化，檢測肺組織中TNF-α等相關(guān)炎癥因子的表達以及NF-κB p65蛋白的磷酸化水平和IκBα蛋白的表達水平，初步探討金骨蓮膠囊的抗炎作用機制，以期更好地指導其臨床合理應用。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：680型酶標儀（上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司），Water purifier型實驗室專用超純水機（沃特世科技上海有限公司），AE240型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），Allegra 64R型低溫高速離心機（美國Beckman Coulter公司），TGL-16G型高速離心機（上海安亭科學儀器廠），DHP-9052型恒溫培養(yǎng)箱（上海捷呈實驗儀器有限公司），ZH-2型渦旋混合器（天津藥典標準儀器廠），Nanodrop2000型紫外-可見分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司），Chemidoc XRS型凝膠成像儀、CFX Connect型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國BioRad公司），DYY-6C型電泳槽（北京六一生物科技有限公司），ECLIPSE CI型光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：金骨蓮膠囊（貴州益佰制藥股份有限公司，批號20190806，規(guī)格0.25 g），LPS（美國Sigma公司，批號039M4004V），地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號171007，規(guī)格0.75 mg），TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司，批號分別為20191111、20190430、20190905、20190621），Trizol試劑（日本Takara公司，批號9109），蘇木素-伊紅（HE）染液（武漢市皮諾飛生物科技有限公司，批號10011），iScript cDNA Synthesis kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、iTaqTM universal SYBR Green Supermix、ECL化學發(fā)光底物（美國BioRad公司，批號分別為170-8890、1725122、1705060），兔源磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）單克隆抗體（中國Abways公司，批號CY5095），兔源NF-κB p65多克隆抗體、兔源IκBα多克隆抗體、鼠源β-actin單克隆抗體（中國ABclonal公司，批號分別為ab16502、A19714、ab6276），辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體（二抗）、BCA蛋白檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為E-AB-1037、E-BC-K318-M）;PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成（引物序列與產(chǎn)物長度見表1）;其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量（300±20） g，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0014。大鼠飼養(yǎng)于照明充足（12 h/12 h光暗調(diào)節(jié)）、空調(diào)通風良好、相對濕度50%、室溫22 ℃的條件下。

2 方法

2.1 動物造模、分組與給藥

將48只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、地塞米松組（陽性對照，0.945 mg/kg，劑量為臨床等效劑量的3倍）和金骨蓮膠囊低、中、高劑量組（0.66、1.32、2.64 g/kg，劑量為臨床等效劑量的5、10、20倍），每組8只。空白對照組和模型組大鼠灌胃等體積水，其余組大鼠灌胃相應藥物（臨用時以水溶解），每天給藥2次，連續(xù)3天。末次給藥后30 min，除空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水外，其余組大鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）以復制炎癥模型。腹腔注射6 h后，于各組大鼠尾靜脈取血，室溫靜置20 min后，以3 000 r/min離心20 min，分離血清，然后采用ELISA法測定各組大鼠血清中TNF-α的含量。如果各組大鼠血清中TNF-α較空白對照組顯著升高，則表明模型建立成功。

2.2 取材

確定造模成功后，于各組大鼠尾靜脈取血，室溫靜置20 min后，以3 000 r/min離心20 min，分離血清樣品。取血后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，剖取其雙肺，將左肺保存于-80 ℃冰箱中，用于PCR和Western blot實驗檢測;將右肺上葉以10%甲醛固定，用于肺組織病理學形態(tài)觀察;將右肺下葉用于肺組織W/D比值的測定。

2.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、 IL-6、PGE2的含量測定

取“2.2”項下各組大鼠血清樣品，按相應試劑盒說明書方法操作，采用酶標儀于450 nm下測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2的含量。

2.4 大鼠肺組織W/D比值測定

取“2.2”項下各組大鼠右肺下葉，用濾紙吸干其表面水分，并稱質(zhì)量，記為濕質(zhì)量（W）;然后于80 ℃恒溫干燥箱中烘烤約48 h后，稱質(zhì)量，記為干質(zhì)量（D）;計算肺組織W/D比值，以反映肺組織的水腫程度。

2.5 大鼠肺組織病理學形態(tài)觀察

取“2.2”項下固定于10%甲醛中的各組大鼠右肺上葉，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度為3 μm）后，以HE染液進行染色，然后于光學顯微鏡下觀察大鼠肺組織的病理學形態(tài)變化，并拍照。

2.6 大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2 mRNA的表達水平檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法進行檢測。取“2.2”項下各組大鼠的左肺組織適量，按照試劑盒說明書方法操作提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)為cDNA進行PCR。PCR反應體系（10 ?L）包括：PCR Mixture 5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，cDNA 2 ?L，H2O 2 ?L。反應條件為：95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采2-ΔΔCt法計算TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2 mRNA的表達水平。

2.7 大鼠肺組織中NF-κB p65磷酸化和IκBα蛋白表達水平的檢測啊

采用Western blot法進行檢測。取“2.2”項下各組大鼠的左肺組織適量，剪碎，加入蛋白提取試劑，提取蛋白質(zhì)，利用組織勻漿儀制備組織勻漿，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度后，加熱變性處理10 min。取變性后蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉1 h;分別加入NF-κB p65一抗（稀釋比例1 ∶ 500）、p-NF-κB p65一抗（稀釋比例1 ∶ 500）、IκBα一抗（稀釋比例1 ∶ 1 000）、β-actin一抗（稀釋比例1 ∶ 10 000），于4 °C條件下孵育過夜;以TBST清洗5 min×5次，加入二抗（稀釋比例1 ∶ 3 000）室溫孵育1 h;以TBST清洗5 min×5次，加入ECL顯色后，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Alpha Ease FC 4.0軟件分析圖像，以p-NF-κB p65與NF-κB p65灰度值比值表示NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，以IκBα蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示IκBα蛋白表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，采用單因素方差分析進行多組間樣本均數(shù)比較，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2含量的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，金骨蓮膠囊低、中、高劑量組和地塞米松組大鼠血清中TNF-α、IL-1β（金骨蓮膠囊低劑量組除外）、IL-6、PGE2含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

3.2 金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠肺組織W/D比值的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D比值顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，金骨蓮高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織W/D比值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表3。

3.3 金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠肺組織病理學形態(tài)的影響

空白對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰、壁薄，肺間質(zhì)無炎癥細胞浸潤;模型組大鼠肺組織出現(xiàn)大量肺泡萎縮塌陷、壁增厚，可見肺實質(zhì)化以及大量炎癥細胞浸潤;金骨蓮低、中、高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織病理學改變較模型組有所減輕，肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰、壁輕度增厚，可見少量炎癥細胞浸潤，詳見圖1（圖中箭頭所指處為炎癥細胞浸潤）。

3.4 金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2 mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，金骨蓮膠囊低、中、高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織中TNF-α（金骨蓮膠囊低劑量組除外）、IL-1β、IL-6（金骨蓮膠囊低、高劑量組除外）、PGE2 mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 金骨蓮膠囊對炎癥模型大鼠肺組織中NF-κB p65磷酸化和IκBα蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白磷酸化水平顯著升高（P<0.05），IκBα蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，金骨蓮膠囊中劑量組和地塞米松組大鼠肺組織中NF-κBp65蛋白磷酸化水平顯著降低（P<0.05），IκBα蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），詳見圖2、表5。

4 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁中的一種組成成分，將其純化后，可用于構(gòu)建動物炎癥模型，且此類模型是目前用于評價抗炎藥物藥效和探索其作用機制的有效體內(nèi)模型[16]。因此，本研究采用腹腔注射LPS復制炎癥模型，以探索金骨蓮膠囊的抗炎作用及機制。在脂多糖的刺激下，炎癥細胞因子的釋放可導致中性粒細胞向肺組織聚集、活化，活化后的中性粒細胞進一步釋放炎性細胞因子，從而破壞肺泡毛細血管屏障，導致肺通透性增加，形成肺水腫[17]，使肺成為最易受損的器官[18-19];而經(jīng)藥物治療后，可通過觀察肺的W/D比值、組織病理改善情況等研究藥物的抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織W/D比值顯著升高，表明其出現(xiàn)了明顯的肺水腫現(xiàn)象;與模型組比較，金骨蓮膠囊高劑量組大鼠肺組織W/D比值顯著降低，表明金骨蓮膠囊可減輕大鼠的肺部水腫。肺組織病理學形態(tài)觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡間隔明顯增厚、大量炎癥細胞浸潤;經(jīng)金骨蓮膠囊干預后，其肺組織病變不同程度地減輕、浸潤的炎癥細胞減少，可見金骨蓮膠囊可減少炎癥細胞浸潤，改善肺組織損傷，減輕LPS所致炎癥反應，產(chǎn)生抗炎作用。

NF-κB通路是炎癥反應的重要轉(zhuǎn)導通路之一[20]。NF-κB未受刺激時主要以非活化狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中，并可與抑制性的IκBα蛋白結(jié)合形成NF-κB/IκBα復合物，而其中IκBα蛋白的活化又被IκBα蛋白激酶復合物控制，該復合物可被外來刺激誘導活化，從而引起IκBα蛋白磷酸化，進而導致IκBα蛋白迅速泛素化降解，釋放出NF-κB p65，使其恢復轉(zhuǎn)錄活性并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，促進細胞炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等的表達[21-23]，同時使環(huán)氧酶（COX）的表達增加，進而促進機體內(nèi)PGE2的表達[24]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2含量均顯著升高，表明LPS使大鼠產(chǎn)生了全身炎癥反應;與模型組比較，金骨蓮膠囊各劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β（低劑量組除外）、IL-6、PGE2的含量，肺組織中TNF-α（高劑量組除外）、IL-1β、IL-6（低、高劑量組除外）、PGE2 mRNA的表達水平均顯著降低，表明金骨蓮膠囊能通過降低上述炎癥因子的表達而產(chǎn)生抗炎作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，金骨蓮膠囊中劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65蛋白磷酸化水平顯著降低，IκBα蛋白表達水平顯著升高，表明金骨蓮膠囊抗炎作用可能與抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

綜上所述，金骨蓮膠囊可抑制大鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2等炎癥因子的表達，減輕脂多糖誘導大鼠的炎癥反應，其作用機制可能與抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)。

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（收稿日期：2020-12-14 修回日期：2021-02-25）

（編輯：唐曉蓮）