單手性半導體碳納米管在生物成像中的研究進展

許文靜，侯軍才，趙建文

1.陜西理工大學材料科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所印刷電子研究中心，江蘇 蘇州 215123

半導體碳納米管(SWCNT)的卓越性能歸功于獨特的sp2碳蜂窩結構，其極佳的電學、光學、機械性能和生物兼容性，使半導體碳納米管成為未來計算機芯片、印刷薄膜晶體管器件和電路、抗輻照電子器件、單光子光源和探測器、能源器件和生物成像等領域最理想的半導體材料之一，相關研究已成為當今科技前沿熱點[1,2]。如半導體碳納米管在近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ，1.0～1.4 μm)中的光致發(fā)光為生物的熒光成像提供了理想探針[3]。但是，多種手性隨機分布的碳納米管帶隙不唯一，在光致發(fā)光時會導致熒光猝滅，這很大程度上限制了碳納米管在生物成像上的應用[4]，而單手性碳納米管具有唯一的帶隙，在激發(fā)源下可以在近紅外二區(qū)表現(xiàn)出強共振激發(fā)，有利于生物體內的熒光成像，并使超低劑量的碳納米管在體內應用成為可能。但目前無法直接生長和制備單手性碳納米管。商業(yè)化的碳納米管主要采用電弧放電[5]、激光燒蝕[6,7]、化學氣相沉積法[8,9]和催化裂解法[10]等制備而成，這些碳納米管中往往包含有多種手性的碳納米管。隨著碳納米管分離技術的發(fā)展，人們采用凝膠色譜法[11]、密度梯度超速離心[12,13]、兩相萃取法[14]和聚合物分離[15]等方法可以將少量的單手性半導體型碳納米管從中分離出來。下面從單手性半導體碳納米管分離和生物成像兩方面進行介紹。

1 單手性碳納米管的分離方法

目前，通過各種方法制備出的碳納米管都是由金屬型碳納米管、半導體型碳納米管、無定形碳和催化劑等雜質組成的混合物。雖然可以通過現(xiàn)有的分離技術將半導體型碳納米管從商業(yè)化碳納米管粉末中分離出來，但是分離出來的半導體碳納米管是多種手性的碳納米管混合物，如何大量、低成本地獲取單手性碳納米管一直是一個挑戰(zhàn)。以下是目前常用分離單手性碳納米管的技術：

(1)凝膠色譜法。利用一種表面活性劑和一系列垂直連接的凝膠柱，對碳納米管進行大規(guī)模手性分離。該方法基于碳納米管與烯丙基葡聚糖的凝膠結構相互作用強度[9]。在頂部色譜柱上，過多的碳納米管分散液會導致色譜柱的吸附位被碳納米管完全占據，未結合的碳納米管流到下一色譜柱中。與凝膠相互作用較強的碳納米管被逐一固定，而其他未固定的碳納米管流到下一色譜柱中，也將被逐一固定在相應的色譜柱中。

(2)密度梯度超速離心法。受生化分離方法的啟發(fā)，美國西北大學Hersam小組首先展示了密度梯度超速離心法半導體碳納米管選擇性分離,這是碳納米管分離領域的一項重大突破[13]。其原理是通過高速離心實現(xiàn)不同密度的碳納米管分層，進而實現(xiàn)單手性的分離。由于密度梯度超速離心法的高選擇性和迭代性質，已實現(xiàn)了99%以上的半導體純度和88%以上的單手性碳納米管富集。但該法需要多步離心，存在設備成本高、操作時間長等缺點，在一定程度上限制了其應用。

(3)兩相水相萃取法。2013年，Khripin等[14]首先報道了用兩相萃取法(ATPE)對碳納米管進行分離。將聚乙二醇和右旋糖酐混合形成兩個不混溶相，由于碳納米管的管徑、長度和手性等不同，碳納米管在聚乙二醇相和富葡聚糖相之間進行選擇性分配，實現(xiàn)分離。

(4)聚合物分選法。2007年，Nish等[15]證明芴基聚合物對半導體型碳納米管顯示出優(yōu)越的包裹能力，且這種方法非常簡單，僅需要兩步：首先，將原始碳納米管粉末與聚合物混合在有機溶液中進行超聲處理，隨后，將超聲處理后的溶液進行高速離心，提取富含半導體碳納米管的上清液。

2 單手性碳納米管的生物醫(yī)學應用

分離純化的半導體碳納米管已開始應用于生物醫(yī)學領域。半導體碳納米管在近紅外生物窗口中顯示出固有的熒光和強大的光學吸收性能，使其成為生物體內成像和光熱療法的理想材料。對于生物醫(yī)學成像，由于生物系統(tǒng)不能吸收近紅外光，因此對可以在近紅外條件下發(fā)光的熒光物質的需求量越來越大。更重要的是，生物組織發(fā)出的光的強度與光的波長有關，即光的波長越長，散射越小，光能可更深入地穿透組織[16,17]。因此，碳納米管是一種適合于在體內深處成像的半導體材料。

碳納米管的一維性質使它們在對應于范霍夫奇點的Eii處具有吸收和發(fā)射特性，并且可以通過調整碳納米管的手性來進一步調節(jié)Eii躍遷的能量[18]。2012年，Diao等[16]對比了HiPCO樣品與富含手性(12,1)&(11,3)的紫外-可見-近紅外吸收光譜圖，如圖1(a)所示，這兩個手性的S11峰與S22峰的位置都很接近，由圖1(b)可以明顯看出(12,1)&(11,3)碳納米管所發(fā)出的熒光更加明亮，富含手性(12,1)&(11,3)的熒光光譜強度是HiPCO樣品的5倍。將200 μL濃度為0.016 mg/mL的(12,1)&(11,3)碳納米管溶注入裸鼠體內，觀測(12,1)&(11,3)碳納米管在裸鼠體內隨時間變化的熒光成像效果，如圖1(c)所示。從圖1可知，(12,1)&(11,3)碳納米管的劑量只需達到HiPCO樣品1/6的注射劑量時就可以實現(xiàn)良好的生物學成像?？紤]到(12,1)&(11,3)碳納米管的純度仍然不高，并且這兩種碳納米管不能以完全相同的波長發(fā)光，該團隊使用密度梯度高速離心法分離出單手性(6,5)碳納米管，進一步優(yōu)化，提高生物成像性能，后續(xù)研究將其用于雙重成像和光熱治療[17]。如圖2所示，與手性分布隨機的未分離的HiPCO相比，單手性碳納米管的純度隨迭代次數(shù)的增加而增加，通過二次迭代富集的(6,5)碳納米管在熒光光譜中的亮度是它們的6倍左右;給裸鼠注射二次迭代后的高純度單手性(6,5)碳納米管后，碳納米管在腫瘤區(qū)域產生了明顯的聚集現(xiàn)象。并且，采用980 nm激光照射碳納米管溶液，富集(6,5)的樣品比未分類的樣品溫度升高幅度更大，這歸因于共振吸收高效地加熱了(6,5)碳納米管，從而使腫瘤成像更加清晰，并達到了所需的光熱腫瘤消融溫度。在基于納米材料體內治療劑中碳納米管非常低劑量時也能實現(xiàn)清晰成像。此外，Antaris等[19]還通過在密度梯度高速離心法分離過程中調節(jié)pH值獲得超高純度單手性(6,4)碳納米管(>99%純度)，并用于近紅外生物成像。單手性(6,4)碳納米管的獨特之處在于S22(873 nm)能量為1.42 eV，可使價格低廉的硅探測器代替昂貴的InGaAs探測器，大幅降低成本，使之在臨床應用中更加實用。

圖1 HiPCO碳納米管與(12,1)&(11,3)碳納米管的(a)紫外-可見-近紅外吸收光譜圖和(b)NIR-II的熒光圖像；(c)裸鼠注入200 μL濃度為0.016 mg/mL的(12,1)&(11,3)碳納米管溶液隨時間變化的熒光圖像(上圖)和裸鼠的PCA圖像(下圖)，其中肺部為綠色，腎臟為粉紅色，肝臟為藍色[16]

圖2 (a) 從左到右分別為HiPCO碳納米管，第一次迭代獲得的(6,5)碳納米管和第二次迭代獲得的(6,5)碳納米管的光學和熒光圖像；(b) 4T1腫瘤裸鼠注射PBS的近紅外熒光圖像；(c) 4T1腫瘤裸鼠注射HiPCO碳納米管溶液的近紅外熒光圖像；(d) 在右肩上帶有4T1腫瘤的小鼠的光學圖像；(e)～(g) 為注射(6,5)碳納米管溶液后6 h、24 h和 48 h的近紅外熒光圖像[17]

2016年，Yomogida等[20]利用凝膠色譜法分離出單手性(9,4)碳納米管，(9,4)碳納米管的發(fā)射和激發(fā)波長位置很有利于生物成像，其S11峰(1101 nm)是水、皮膚和黏液的低吸收區(qū)，S22(724 nm)是含氧血紅蛋白的低吸收區(qū)[21]。如圖3所示，使用分離的(9,4)碳納米管作為熒光探針進行了小鼠脈管系統(tǒng)的近紅外熒光成像。由于每單位質量的吸收和發(fā)射強度高，經表面活性劑交換的生物相容性(9,4)碳納米管的熒光強度是原始HiPCO碳納米管的20倍，可清晰顯示出血管和深部內臟，具有較高的信號強度。

圖3 (a) 注射34 μg的(9,4)碳納米管(左圖)和128 μg的HiPCO 碳納米管的裸鼠的熒光圖像(右圖)；(b) 注射劑量不同的(9,4)碳納米管(1.7～0.17 μg每只小鼠)與未注射的裸鼠的熒光圖像對照(上圖)，并調節(jié)至最佳對比度后的熒光圖像(下圖)[20]

研究表明，即使在沒有靶向劑的情況下，被注射到裸鼠體內的碳納米管也會在裸鼠接種的腫瘤中積累[16,22]，惡性腫瘤的特點是大量繁殖并發(fā)生轉移。目前，癌癥的治療方法是手術、化療和放射療法去除病變的整個腫塊，但是，由于癌細胞通過淋巴和血液系統(tǒng)擴散，因此很難通過手術完全去除轉移性病變[23]。因此，為了了解癌癥的轉移路徑，除了檢測原發(fā)腫瘤外，還必須可視化癌細胞的轉移。曾有研究發(fā)現(xiàn)通過氧摻雜化學修飾可以改變碳納米管的激發(fā)與吸收波長[24]，2019年，Sekiyama等[25]使用紫外燈照射(6,5)碳納米管，對(6,5)碳納米管形成氧摻雜，使(6,5)碳納米管發(fā)射峰位置紅移至1280 nm，探究通過摻雜調控后的碳納米管是否可以標記癌細胞轉移，將氧摻雜的碳納米管用PEG(聚乙二醇)處理后使其具有更好的生物兼容性(O-SWCNT-PEG)。如圖4(a)所示，將腫瘤Colon-26細胞置于富含O-SWCNT-PEG的培養(yǎng)基中，每兩天更換一次含有O-SWCNT-PEG的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)熒光強度會隨著時間推移逐漸增加。圖4(b)作為對照組，第一天和第二天將腫瘤Colon-26細胞置于富含O-SWCNT-PEG的培養(yǎng)基中，第三天開始更換不含O-SWCNT-PEG的培養(yǎng)基，注意到直到第5天，細胞中O-SWCNT-PEG才開始出現(xiàn)熒光圖像，表明熒光強度隨時間和O-SWCNT-PEG濃度增加而增加。

圖4 第1、3、5和7天在980 nm激光激發(fā)下，帶有Colon-26細胞的O-SWCNT-PEG的近紅外二區(qū)熒光圖像(a) 將Colon-26細胞放在濃度為1.6 μg/ mL的O-SWCNT-PEG培養(yǎng)基中，每48 h更換一次含有O-SWCNT-PEG培養(yǎng)基； (b) 作為對照組，在第0～2天用濃度為1.6 μg/mL的O-SWCNT-PEG培養(yǎng)基后，更換不含O-SWCNT-PEG的培養(yǎng)基(綠色表示O-SWCNT-PEG的近紅外二區(qū)熒光圖像)[25]

如上所述，通過化學摻雜對單手性碳納米管的發(fā)射和吸收峰進行調控使之紅移，近紅外二區(qū)單手性碳納米管對光的散射非常弱，從而提供更好的穿透深度，并減少對自發(fā)熒光的干擾。大管徑半導體碳納米管能夠在更長的波長(如>1400 nm)下進行生物成像，這使得對大直徑的單手性半導體碳納米管的需求越來越迫切[26]。如何分離純化管徑更大的半導體碳納米管并研究其在生物成像等領域中的應用,已成為碳基電子里的一大研究熱點。

3 展望

要真正實現(xiàn)單手性半導體型碳納米管的應用，首先需要在單手性半導體碳納米管可控生長和合成純化等方面進行深入研究，同時需進一步開發(fā)以實現(xiàn)大量高純度的單手性半導體型碳納米管富集技術。盡管目前在實現(xiàn)這些目標方面取得了重大進展，但生長和富集的方法主要集中在小管徑的單手性碳納米管上，最具代表性的材料是(6,5)碳納米管。因此，應重點致力于能普遍應用的不同管徑的單手性碳納米管生長與富集的研究，特別是管徑>1 nm的單手性半導體碳納米管。單手性半導體碳納米管的獨特特性使其不僅能夠熒光成像標記腫瘤，同時還有望用于治療，目前雖還在實驗階段，但已經在生物醫(yī)學上展現(xiàn)出了巨大的潛力。除在生物醫(yī)學中，單手性半導體碳納米管也在計算機芯片、能源電池、單光子發(fā)射器與單光子探測器等方面有著潛在的優(yōu)勢和發(fā)展前景。