表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)H22 肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用

彭 靜陳 曦

（1.樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院中醫(yī)教研室，四川 樂(lè)山614000； 2.樂(lè)山市市中區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，四川 樂(lè)山614000）

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯是從綠茶中提取的多酚類化合物，具有干預(yù)代謝酶活性、保護(hù)心腦血管功能、調(diào)節(jié)免疫內(nèi)分泌、降低氧化應(yīng)激水平及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性，得到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注［1］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的抗腫瘤作用被廣泛研究，其具有抗胃癌、肺癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等作用［2?4］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯具有較高的體內(nèi)抑瘤活性，能夠通過(guò)抗氧化作用抑制H22小鼠腫瘤增長(zhǎng)［5］。此外，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以聯(lián)合紫杉醇、多柔比星等化療藥物，通過(guò)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡等作用，發(fā)揮協(xié)同抗肝癌效果［6?7］。本研究擬在進(jìn)一步明確表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯抗肝癌作用的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)免疫功能與VEGF、MMP2、MMP9 表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明抗肝癌機(jī)制。

1 材料

1.1 瘤株與動(dòng)物 小鼠肝癌H22細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。SPF 級(jí)昆明種小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK（京）2014?0004。

1.2 藥物與試劑 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（批號(hào)170718，純度＞98.0%），購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；5?氟尿嘧啶（批號(hào)20180109），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；白細(xì)胞介素?2（IL?2）及腫瘤壞死因子?α（TNF?α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)分別為180624、181008），購(gòu)自南京建成生物工程研究所；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）及MMP9 抗體（批號(hào)分別為G0815、SC?13595、SC?16840），購(gòu)自美國(guó)Santa公司；甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗 體（批 號(hào)20181204），購(gòu)自杭州華安生物科技有限公司。

1.3 儀器 BSC?1100IIA2?X 生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；I160 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma 公司）；CX31 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HC?2518RHC 高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳儀器公司）；Mini?PROTEAN蛋白電泳儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）；HBS?1096A 酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 H22肝癌荷瘤小鼠模型建立及分組、給藥 小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、5?氟尿嘧啶組及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高劑量、低劑量組，每組10 只。采用10%胎牛血清（含100 U／mL 雙抗），在飽和濕度、5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，于小鼠腹腔中接種。小鼠腹部膨大后，處死小鼠，無(wú)菌操作抽取腹水，并調(diào)整至1×106／mL，模型組、5?氟尿嘧啶組、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高劑量及低劑量組小鼠右腋皮下接種0.2 mL，正常組小鼠相同位置注射等體積生理鹽水。接種次日給藥，5?氟尿嘧啶組腹腔注射20 mg／kg 5?氟尿嘧啶，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高劑量及低劑量組分別灌胃80、40 mg／kg的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，持續(xù)7 d；正常組及模型組小鼠灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 抑瘤率及臟器指數(shù)計(jì)算 末次給藥24 h 后稱定小鼠體質(zhì)量，隨后摘眼球取血，分裝。一部分用于血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定，一部分離心后分離血清，用于IL?2 及TNF?α 水平測(cè)定。頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離瘤塊、脾臟及胸腺，精密稱重，分別計(jì)算抑瘤率、脾臟及胸腺指數(shù)。抑瘤率＝［（模型組平均瘤質(zhì)量－藥物處理組平均瘤質(zhì)量）／模型組平均瘤質(zhì)量］ ×100%，脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量／體質(zhì)量，胸腺指數(shù)＝胸腺質(zhì)量／體質(zhì)量。

2.3 血液常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 取“2.2”項(xiàng)下分裝的小鼠血液，采用小動(dòng)物全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定各組小鼠血液中血紅蛋白水平及紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)。

2.4 血清IL?2 及TNF?α 水平測(cè)定 取“2.2”項(xiàng)下分裝的血清，按照試劑盒說(shuō)明書中的操作步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定各組小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平。

2.5 瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達(dá)測(cè)定 取各組小鼠瘤組織，勻漿，提取瘤組織總蛋白并定量。采用SDS?PAGE 電泳進(jìn)行目的蛋白的分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入VEGF、MMP2、MMP9（1 ∶1 000）抗體，4 ℃放置12 h。洗膜后，HRP 標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育4 h，洗膜后進(jìn)行曝光顯影。蛋白相對(duì)表達(dá)量為目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白灰度值之比。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 通過(guò)SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（）表示，單因素方差分析用于多組間比較，組間兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Dunntt’s T3，方差齊時(shí)采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)量及抑瘤率的影響 實(shí)驗(yàn)前，各組小鼠體質(zhì)量無(wú)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)后，與正常組比較，模型組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠體質(zhì)量降低（P＜0.01），而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明5?氟尿嘧啶嚴(yán)重影響荷瘤小鼠的生長(zhǎng)，對(duì)荷瘤小鼠機(jī)體存在明顯的損傷。與模型組比較，5?氟尿嘧啶組及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤重降低（P＜0.01），抑瘤率分別為52.2%、36.3%、29.2%，說(shuō)明5?氟尿嘧啶及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯均可以明顯抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。見表1。

表1 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤重及抑瘤率的影響（， n＝10）

表1 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量、瘤重及抑瘤率的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低（P＜0.01）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均進(jìn)一步降低（P＜0.01），而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以增加小鼠免疫器官的質(zhì)量，提升小鼠的免疫能力。見表2。

表2 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（， n＝10）

表2 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠臟器指數(shù)的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響 各組小鼠血液血紅蛋白水平、紅細(xì)胞數(shù)變化無(wú)差異（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血液白細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠白細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.01），而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠白細(xì)胞數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以增加荷瘤小鼠的白細(xì)胞數(shù)，提升小鼠的免疫能力。見表3。

表3 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響（， n＝10）

表3 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響 ELISA 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，5?氟尿嘧啶組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平進(jìn)一步降低（P＜0.01），而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠血清IL?2、TNF?α 水平增加（P＜0.05，P＜0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以通過(guò)提高免疫因子的水平，提升小鼠的免疫能力。見表4。

表4 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響（， n＝10）

表4 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，5?氟尿嘧啶組及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01），其中5?氟尿嘧啶組下降幅度更為明顯。見表5、圖1。

表5 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達(dá)的影響（， n＝10）

表5 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)荷瘤小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9 表達(dá)的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠瘤組織VEGF、MMP2、MMP9表達(dá)

4 討論

機(jī)體的免疫能力與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。脾臟及胸腺是最主要的免疫器官，研究發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠脾臟及胸腺常出現(xiàn)萎縮，而免疫促進(jìn)劑可使其質(zhì)量得到部分恢復(fù)［8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以增加小鼠免疫器官的質(zhì)量，也可以升高白細(xì)胞數(shù)，具有提升小鼠免疫能力的作用。為進(jìn)一步確認(rèn)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的抑瘤作用及免疫保護(hù)作用，本研究對(duì)各組小鼠血清IL?2 及TNF?α 水平進(jìn)行了檢測(cè)。IL?2 是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞免疫因子，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中起到中心調(diào)節(jié)的作用，可以刺激免疫細(xì)胞活化，促進(jìn)T 細(xì)胞的增殖和分化，提高機(jī)體免疫機(jī)能［9］。研究發(fā)現(xiàn)，貞芪酪蛋白肽復(fù)合物可以提高Lewis 肺癌荷瘤模型小鼠血清IL?2 水平，發(fā)揮抗Lewis 肺癌作用［10］。TNF?α 是目前已知的具有抗腫瘤作用最強(qiáng)的細(xì)胞免疫因子，其可以促進(jìn)T 細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，增強(qiáng)宿主免疫功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；也可以直接殺傷腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用［11］。研究發(fā)現(xiàn)［12］，白花丹醌具有體內(nèi)抗肝癌H22移植性腫瘤模型小鼠腫瘤活性，其機(jī)制可能與增加TNF?α 的水平有關(guān)。因此，IL?2 和TNF?α 的水平可直接反映機(jī)體的免疫功能和抗腫瘤活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以通過(guò)提高免疫因子IL?2 和TNF?α 的水平，提升小鼠的免疫能力；而免疫能力的提高是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯發(fā)揮抗肝癌作用的潛在機(jī)制。

VEGF 能誘導(dǎo)蛋白水解酶、間質(zhì)膠原酶等促使新生血管形成，從而為腫瘤生長(zhǎng)提供基礎(chǔ)［13?14］。研究［15］發(fā)現(xiàn)，化痰消瘤方通過(guò)降低VEGF 的表達(dá)，抑制Lewis 肺癌瘤體生長(zhǎng)。在生理?xiàng)l件下，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的降解、分泌及活性受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和控制，而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，MMP2 及MMP9 等表達(dá)異常增加，進(jìn)而引起腫瘤的生長(zhǎng)［16］。大量研究證實(shí)，多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)與MMP2、MMP9 的異常高表達(dá)有關(guān)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)抑制外周血和腫瘤組織中MMP2、MMP9 的表達(dá)，發(fā)揮抗宮頸癌作用［18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯高、低劑量組小鼠瘤組織VEGF、MMP2 及MMP9表達(dá)均降低，進(jìn)一步提示其具有抑制H22肝癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的潛在作用。

肝癌起病隱匿、進(jìn)展迅速，是影響人類健康的重大疾病之一，借助化學(xué)藥物進(jìn)行的化療是中、晚期肝癌的主要治療手段。傳統(tǒng)化療藥物由于不良反應(yīng)大，對(duì)機(jī)體損害嚴(yán)重，整體效果難以令人滿意［19］。本研究結(jié)果最終表明，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可以明顯抑制H22肝癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，該作用與提高免疫力及抑制VEGF、MMP2、MMP9 表達(dá)有關(guān)。此發(fā)現(xiàn)，為把表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯開發(fā)成為具有抗肝癌作用的臨床藥物提供了理論依據(jù)。