白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

楊 娟鐘 瑩尚曙玉賈 安

（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州450006）

白藜蘆醇是一種天然多酚類(lèi)蒽醌萜化合物，主要存在于決明子、葡萄、虎杖、松樹(shù)等果實(shí)或植物中，具有保護(hù)心血管、抗風(fēng)濕、調(diào)血脂等作用［1?2］，可通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化和凋亡、抑制癌細(xì)胞增殖、抑制環(huán)氧化酶等機(jī)制對(duì)宮頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤具有較好的療效［3］。但該成分在水中的溶解度低（僅為28.3 μg／mL）［4］，穩(wěn)定性差［5］，大大限制了藥物體內(nèi)吸收，口服后絕對(duì)生物利用度也僅為5%［6］，故開(kāi)發(fā)相關(guān)新型口服制劑具有較高的研究?jī)r(jià)值。

課題組前期曾采用磷脂復(fù)合物技術(shù)對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行基本性質(zhì)研究［4］，但并未進(jìn)行體內(nèi)評(píng)價(jià)，所得產(chǎn)品是一種半固體、疏水性、分散性差的物質(zhì)［7?8］，不僅難以進(jìn)行制劑學(xué)研究，也使藥物溶出度或生物利用度的提高程度有限［9?10］。近年來(lái)，將納米制劑技術(shù)應(yīng)用到磷脂復(fù)合物制備中的研究越來(lái)越多［11?15］，可有效解決后者固有缺陷，故本實(shí)驗(yàn)將白藜蘆醇磷脂復(fù)合物制成固體脂質(zhì)納米粒，對(duì)其粒徑、Zeta 電位、溶出度、穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，以期為該制劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀，配置G7115A 檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；BSA224S 型電子天平，配置防風(fēng)罩（德國(guó)Sartorius公司）；P180H 型超聲儀（德國(guó)Elma 公司）；DW?40／60 W 型超低溫冰箱（浙江和利制冷設(shè)備有限公司）；78?1 型磁力攪拌器（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；XW?80A 型漩渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；Nano?S90li 粒度分析儀（英國(guó)Malvern 公司）；YOYN?DCY?24Y 型氮?dú)獯祾邇x（上海喬躍電子科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白藜蘆醇原料藥（批號(hào)19122?3，純度98.0%，臺(tái)州市博納化工有限公司）；白藜蘆醇對(duì)照品（批號(hào) 111535?201808，純度98.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。卵磷脂（批號(hào)190515，磷脂酰膽堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%，上海太偉藥業(yè)有限公司）；泊洛沙姆188（批號(hào)GN28622DT，德國(guó)BASF公司）；單硬脂酸甘油酯（批號(hào)150813，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。四氫呋喃為色譜純（批號(hào)T818769?4 L，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2016?0001，在課題組實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 白藜蘆醇含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)［16］ 報(bào)道。Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)加預(yù)柱（4 mm×4 mm，5 μm）；流動(dòng)相水（含0.1%磷酸）?乙腈（70 ∶ 30）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm；進(jìn)樣量20 μL。含量測(cè)定過(guò)程中注意避光，白藜蘆醇色譜峰理論塔板數(shù)不低于9 500，對(duì)稱(chēng)因子為1.04。

2.1.2 供試品溶液制備 取白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒混懸液1 mL，置于10 mL 量瓶中，加入5 mL 乙腈超聲處理2 min，靜置至室溫后流動(dòng)相定容至刻度，－4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，取5 mL 上清液至10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 稱(chēng)取白藜蘆醇對(duì)照品30 mg，置于100 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解后定容至300 μg／mL，流動(dòng)相依次稀釋至60、30，15、5、0.5、0.25 μg／mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以白藜蘆醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝18.254 7X＋1.967 1（r＝0.999 8），在0.25～60 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 方法學(xué)考察 取供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白藜蘆醇峰面積RSD 為0.72%，表明溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。取同一份白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙?，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得白藜蘆醇含量RSD 為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得白藜蘆醇峰面積RSD 為0.36%，表明儀器精密度良好。取“2.1.3”項(xiàng)下300 μg／mL 對(duì)照品溶液8 mL，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容至刻度，得到240 μg／mL 溶液，取9 份白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒混懸液1 mL，分別置于10 mL量瓶 中，加入上述溶液0.8、1.0、1.2 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得白藜蘆醇平均加樣回收率分別為99.36%、100.63%、100.14%，RSD 分別為0.67%、1.02%、0.84%。

2.2 白藜蘆醇磷脂復(fù)合物及其固體脂質(zhì)納米粒制備

2.2.1 磷脂復(fù)合物 根據(jù)文獻(xiàn)［4］ 報(bào)道的方法制備，并略作調(diào)整。稱(chēng)取白藜蘆醇0.3 g、卵磷脂1.0 g，置于圓底燒瓶中（比例1 ∶1），加入150 mL四氫呋喃后立即密封，置于45 ℃水浴中，恒溫條件下磁力攪拌3 h，得澄清溶液，同溫下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得淺黃色半固體狀態(tài)物質(zhì)。由于白藜蘆醇不溶于二氯甲烷，而磷脂復(fù)合物易溶于后者，故將半固體狀態(tài)物質(zhì)置于20 mL 該溶劑中，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾除去未形成磷脂復(fù)合物的白藜蘆醇，45 ℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，即得（淺黃色半固體狀態(tài)）。

2.2.2 固體脂質(zhì)納米粒 課題組前期以包封率為指標(biāo)，在固定磷脂復(fù)合物用量75 mg 的前提下對(duì)脂質(zhì)材料種類(lèi)（硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三萮酸甘油酯）、用量（350、400、450、500 mg）、表面活性劑體積分?jǐn)?shù)（0.5%、1%、1.5%）進(jìn)行考察，最終確定最優(yōu)制備工藝為稱(chēng)取單硬脂酸甘油酯450 mg、白藜蘆醇磷脂復(fù)合物75 mg，置于圓底燒瓶中，加入20 mL 無(wú)水乙醇，加熱至65 ℃后攪拌溶解，作為有機(jī)相；配制含1%泊洛沙姆188 的溶液60 mL，加熱至65 ℃，作為水相，將有機(jī)相在磁力攪拌條件下滴入水相，滴畢后繼續(xù)攪拌30 min，減壓旋蒸揮盡無(wú)水乙醇，得到初乳，設(shè)置超聲波細(xì)胞粉碎儀功率為300 W（每工作2 s 后停止2 s），將初乳置于冰水混合物中，在超聲波細(xì)胞粉碎儀中超聲處理5 min，再立即置于－10 ℃冰箱中固化5 min，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，補(bǔ)加蒸餾水至60 mL，即得。

2.3 包封率、載藥量測(cè)定 取1 mL 混懸液至超濾離心管中，在－4 ℃下10 000 r／min 離心45 min，取續(xù)濾液，測(cè)定白藜蘆醇含量（m游離），取1 mL混懸液，加入5 mL 乙腈超聲處理2 min，靜置至室溫后定容至刻度，在－4 ℃下10 000 r／min 離心10 min，取5 mL 上清液，置于10 mL 量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，測(cè)定白藜蘆醇總含量（m總），按照文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道的方法測(cè)定包封率、載藥量，測(cè)得3 批白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒兩者平均值分別為84.07%、2.62%。

2.4 粒徑、Zeta 電位測(cè)定 取3 批白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒混懸液，蒸餾水稀釋50 倍后各取3.5 mL，置于比色皿中，測(cè)定粒徑、Zeta 電位，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由此可知，3 批樣品平均粒徑為218.6 nm，PDI 為0.034，Zeta 電位為－15.6 mV。

圖1 白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of solid lipid nanoparticles of resveratrol phospholipids complex

圖2 白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of solid lipid nanoparticles of res?veratrol phospholipids complex

2.5 凍干粉制備 取白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米?；鞈乙哼m量，置于西林瓶中，分別加入2%、3.5%、5% 凍干保護(hù)劑（葡萄糖、蔗糖、甘露醇）適量，混勻，封口膜封口，將西林瓶垂直置于－60 ℃冰箱預(yù)凍1 d 后取出，封口膜扎孔，放入－40 ℃凍干機(jī)中抽真空，冷凍干燥2 d，即得，其外觀、色澤、粒徑見(jiàn)表1。由此可知，甘露醇用量為3.5%、5%時(shí)各指標(biāo)均較佳，考慮到成本，最終選擇3.5%甘露醇作為凍干保護(hù)劑。

表1 凍干保護(hù)劑對(duì)凍干粉外觀、色澤、粒徑的影響（）Tab.1 Effects of lyoprotectant on the appearance，colour and particle size of lyophilized powder（）

表1 凍干保護(hù)劑對(duì)凍干粉外觀、色澤、粒徑的影響（）Tab.1 Effects of lyoprotectant on the appearance，colour and particle size of lyophilized powder（）

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取白藜蘆醇磷脂復(fù)合物及其固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，置于5 mL 蒸餾水中，使白藜蘆醇含量均為0.5 mg／mL，超聲處理2 min后，于0、1、2、3、6、8、12、24、36、48 h 取混懸液適量，振蕩混勻后過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算白藜蘆醇含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，白藜蘆醇含量逐漸降低，表明磷脂復(fù)合物在水相中穩(wěn)定性較差；制成固體脂質(zhì)納米粒后，白藜蘆醇含量下降速度大大降低，表明該劑型對(duì)包裹于其中的磷脂復(fù)合物起到了明顯的保護(hù)作用［17］。

圖3 白藜蘆醇體外穩(wěn)定性曲線Fig.3 In vitro stability curves for resveratrol

2.7 體外釋藥研究 白藜蘆醇在1%SDS 溶液中的溶解度為66.31 μg／mL，可滿(mǎn)足10 mg 該成分在900 mL 該溶液中的漏槽條件，故以其為釋放介質(zhì)。取白藜蘆醇原料藥、磷脂復(fù)合物及其固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，白藜蘆醇含量均為10 mg，加入3 mL 1%SDS 溶液制備混懸液，轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量14 000 Da）中，固定于攪拌槳葉上，并對(duì)溶出儀作避光保護(hù)。配制900 mL 1%SDS 溶液，設(shè)置溶出儀轉(zhuǎn)速及溫度分別為75 r／min、37 ℃，于0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h 各取樣3 mL，同時(shí)補(bǔ)加空白溶出介質(zhì)3 mL，5 000 r／min 離心10 min，取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，原料藥在48 h 內(nèi)累積溶出度為27.93%；制成磷脂復(fù)合物后雖有提高，但仍不足45%，并且透析袋中仍有磷脂復(fù)合物存在，而將其進(jìn)一步制成固體脂質(zhì)納米粒后達(dá)到76.18%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 白藜蘆醇體外釋藥曲線Fig.4 In vitro drug release curves for resveratrol

2.8 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.8.1 分組、給藥與采血 取白藜蘆醇及其磷脂復(fù)合物、固體脂質(zhì)納米粒凍干粉適量，加入0.5%CMC?Na 溶液，制成2 mg／mL 混懸液。18 只大鼠隨機(jī)分為3 組，每組6 只，分別灌胃給予相應(yīng)混懸液，劑量均為20 mg／kg，然后迅速乙醚麻醉，于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 眼內(nèi)眥靜脈采血各約0.3 mL，置于肝素浸潤(rùn)的EP 管中，渦旋30 s，－4 ℃下2 500 r／min 離心3 min，取上層淺色含藥血漿，密封并冷凍保存。

2.8.2 血樣前處理 精密量取“2.8.1”項(xiàng)下血漿樣品100 μL，置于1.5 mLEP 管中，加入300 μL乙腈，渦旋5 min 以沉淀蛋白及血漿內(nèi)源性物質(zhì)，在－4 ℃下10 000 r／min 離心20 min，分取上清液，氮?dú)饩徛蹈?，加?00 μL 乙腈復(fù)溶，4 ℃下10 000 r／min 離心8 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.8.3 線性關(guān)系考察 健康大鼠麻醉后心臟取血，制備空白血漿，備用。精密稱(chēng)取白藜蘆醇對(duì)照品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，依次稀釋至2 000、1 000、500、250、100、50 ng／mL，各精密量取100 μL 至EP 管中，氮吹儀上氮?dú)饩徛蹈?，加?00 μL 空白血漿，渦旋10 min 后混 勻，得到2 000、1 000、500、250、100、50 ng／mL 血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），白藜蘆醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.602 8X＋5.114 9（r＝0.992 4），在50～2 000 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿對(duì)照品、血漿樣品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5，可知血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定，表明該方法專(zhuān)屬性良好。取血漿樣品，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白藜蘆醇峰面積RSD 為1.63%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取50、500、2 000 ng／mL 血漿對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得白藜蘆醇峰面積RSD 分別為9.82%、6.07%、4.11%，表明儀器精密度良好。制備100、500、1 000 ng／mL對(duì)照品溶液，各精密量取100 μL，氮?dú)獯蹈?，加?00 μL 空白血漿，渦旋混勻，按“2.8.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得白藜蘆醇平均加樣回收率分別為90.13%、94.69%、92.07%，RSD 分別1.26%、0.77%、1.90%，符合2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的生物樣品分析要求。另外，該方法定量限、檢測(cè)限分別為4、1 ng／mL。

圖5 白藜蘆醇HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of resveratrol

2.8.5 結(jié)果分析 圖6、表2 顯示，白藜蘆醇磷脂復(fù)合物tmax無(wú)明顯變化（P＞0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.05，P＜0.01），相對(duì)生物利用度與原料藥相比增加至1.55 倍；將其進(jìn)一步制成固體脂質(zhì)納米粒后，tmax延長(zhǎng)（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對(duì)生物利用度與原料藥相比增加至3.00 倍。

圖6 白藜蘆醇血藥濃度?時(shí)間曲線Fig.6 Plasma concentration?time curves for resveratrol

表2 白藜蘆醇主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for resveratrol（， n＝6）

表2 白藜蘆醇主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（， n＝6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for resveratrol（， n＝6）

注：與白藜蘆醇比較，**P＜0.01；與白藜蘆醇磷脂復(fù)合物比較，＃＃P＜0.01。

3 討論

磷脂在處方中可作為復(fù)合物、固體脂質(zhì)納米粒的載體及表面活性劑等，近幾年在制劑領(lǐng)域受到頗多關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)制備的白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒與文獻(xiàn)［18?19］ 報(bào)道的白藜蘆醇納米制劑相比，包封率更高。體外穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，磷脂復(fù)合物在水中不穩(wěn)定，白藜蘆醇含量下降程度較明顯，可能與前者物理穩(wěn)定性不高、后者遇光容易降解［17］等因素有關(guān)。但在體外溶出試驗(yàn)中，磷脂復(fù)合物累積溶出度呈上升趨勢(shì)，這是因?yàn)樗锹┎蹢l件下進(jìn)行測(cè)定，從中析出的原料藥可能重新溶于溶出介質(zhì)中，并作了避光處理，可降低光照對(duì)白藜蘆醇含量的影響［17］。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，磷脂復(fù)合物可將白藜蘆醇的口服吸收生物利用度提高至1.55 倍，而白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與磷脂復(fù)合物相比顯著升高，生物利用度進(jìn)一步增至3.00 倍，其原因一方面是由于固體脂質(zhì)納米粒可提高磷脂復(fù)合物的穩(wěn)定性，降低藥物與磷脂之間的解離，改善復(fù)合物分散性，促進(jìn)藥物溶出；另一方面，它發(fā)揮了納米制劑特殊的吸收機(jī)制［20?21］，有助于促進(jìn)藥物高效吸收。今后，將對(duì)白藜蘆醇磷脂復(fù)合物固體脂質(zhì)納米粒的體內(nèi)藥效學(xué)作進(jìn)一步評(píng)價(jià)［22］，從而更好地開(kāi)發(fā)利用該制劑。