雙子表面活性劑溶液中大黃蒽醌類化合物與牛血清白蛋白的相互作用

劉凡

（樂山師范學(xué)院化學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，四川 樂山614004）

引言

血清白蛋白是具有運(yùn)輸藥物分子、維生素、生理激素及電解質(zhì)功能的生物大分子。血清白蛋白可與進(jìn)入體內(nèi)藥物分子迅速、可逆地結(jié)合，并作為載體將藥物運(yùn)輸至治療靶點(diǎn)而發(fā)揮藥效，同時(shí)血清白蛋白與藥物結(jié)合力和結(jié)合率的差異可使得留存于血漿中的藥物含量發(fā)生較大幅度的波動(dòng)，從而影響到藥物藥效發(fā)揮以及治療結(jié)果。因此研究血清白蛋白與藥物的相互作用，可以在分子層面認(rèn)識(shí)藥物在生物體內(nèi)的分布、代謝情況以及二者間結(jié)合藥理、毒理作用機(jī)理，為設(shè)計(jì)、篩選、開發(fā)高活性、低毒性的藥物分子具有重要理論和實(shí)際意義。

大黃為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥物，主要包括蒽醌類、鞣質(zhì)類、多糖類等醫(yī)用活性化合物80余種，其中大黃蒽醌類化合物（RAA）包含大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、異大黃素以及蟲漆酸D等［1］，這類化合物具有廣泛的藥理作用，在臨床醫(yī)學(xué)上用于對多種疾病的治療，例如抗病毒［2］、抗菌［3］、抗炎［4］、抗腫瘤［5-9］、降脂降壓［10］及藥物緩釋作用［11-12］等。由于結(jié)合后形成的大黃蒽醌類化合物-牛血清白蛋白（RAA-BSA）超分子二元體系不易穿透毛細(xì)血管壁、血腦屏障等多種生物膜［13］，將影響大黃蒽醌類化合物在生物體內(nèi)的藥理和藥效。因此以雙子表面活性劑分子聚集形成膠束或囊泡，作為模擬生物膜，研究BSA與RAA的相互作用，探討B(tài)SA與大黃素類藥物的結(jié)合力和結(jié)合率，認(rèn)識(shí)大黃類藥物在生物體內(nèi)的運(yùn)輸、分布、代謝情況，這對提高大黃類藥物療效有極其重要的意義，然而研究RAA與BSA相互作用［13-14］的報(bào)道較少。本文在雙子表面活性劑膠束模擬生物膜的介質(zhì)中，應(yīng)用熒光光譜法和紫外光譜法研究了RAA與BSA的相互作用，結(jié)果顯示膠束-RAA二元配合物對BSA的內(nèi)源熒光有更強(qiáng)的猝滅作用，并得到在水和膠束溶液中的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合點(diǎn)位數(shù)，根據(jù)RAA與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)，確定它們之間的作用力主要為靜電力和氫鍵。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)（Cary Eclipse型，帶恒溫裝置，美國安捷倫公司），紫外分光光度計(jì)（UV2200型，北京瑞利公司），酸度計(jì)（pH307型，上海儀電儀器有限責(zé)任公司）。

牛血清白蛋白（BSA，上海伯奧生物科技有限責(zé)任公司），大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素（阿拉丁公司），α，δ-丁撐-N，N-二甲基十二烷基溴化銨（C12-C4-C12）、α，ζ-己撐-N，N-二甲基十六烷基溴化銨（C16-C6-C16）（本院合成，經(jīng)核磁/紅外表征），三羥甲基氨基甲烷（Tris），氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在比色皿中依次加入1.50 mL Tris-HCl緩沖溶液，0.20 mL Gemini表面活性劑的水溶液，0.30 mL牛血清白蛋白溶液，再用水稀釋至3.00 mL，置于熒光分光光度計(jì)內(nèi)恒溫5 min，再加入一定量的RAA的甲醇溶液（≤80μL），以285 nm為激發(fā)波長，發(fā)射狹縫和激發(fā)狹縫均為5 nm，測定該系列溶液的熒光發(fā)射光譜圖，并測量熒光峰值的熒光強(qiáng)度。

以類似的實(shí)驗(yàn)方法測定溶液在波長為295 nm～495 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 RAA與BSA作用的熒光發(fā)射光譜

BSA由于色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸等殘基而發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光。根據(jù)相關(guān)研究［14-15］表明表面活性劑膠束與BSA中具有內(nèi)源性熒光的氨基酸殘基增溶或結(jié)合生成二元復(fù)合物，形成“珍珠項(xiàng)鏈?zhǔn)健苯Y(jié)構(gòu)，使得BSA的熒光強(qiáng)度發(fā)生衰減，再加入猝滅劑RAA，研究體系形成三元復(fù)合物，體系的熒光強(qiáng)度隨猝滅劑濃度的增大而減弱，如圖1所示。

圖1 298K時(shí)大黃素對BSA熒光光譜的影響（a：水溶液，b：C12-C4-C12溶液）（［BSA］=2.5×10-5 mol·L-1，［Emodin］=0，0.33×10-5 mol·L-1，0.67×10-5 mol·L-1，1.00×10-5 mol·L-1，1.33×10-5 mol·L-1，1.67×10-5 mol·L-1，2.00×10-5 mol·L-1，2.33×10-5 mol·L-1，2.67×10-5 mol·L-1，［C12-C4-C12］=1.0×10-3 mol·L-1）

2.2 RAA與BSA作用機(jī)理

客體小分子對主體生物大分子熒光猝滅分為兩種：其一是由于主客體分子間的碰撞而發(fā)生的動(dòng)態(tài)猝滅；其二是大小分子間生成主客體復(fù)合物而產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅。如果客體對主體是動(dòng)態(tài)猝滅，則符合Stern-Volmer方程：

其中F0和F分別為未加入和加入客體的最大熒光強(qiáng)度，Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，Kq為猝滅速率常數(shù)，τ0為BSA熒光分子平均壽命（×10-8s），Dt為猝滅劑濃度。以（F0-F）/F對Dt作圖，得到Sterm-Volmer曲線（圖2），通過線性擬合得到值Ksv及Kq值，見表1。

由表1數(shù)據(jù)表明，在水溶液及膠束溶液中RAA對BSA的碰撞猝滅速率常數(shù)（1.26×1012L·mol-1·s-1～6.98×1012L·mol-1·s-1）遠(yuǎn)大于小分子猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)（2.0×1010L·mol-1·s-1）；且在同一溶液中碰撞猝滅速率常數(shù)Kq，289k＞Kq，310k，即Kq隨溫度的升高而減小，復(fù)合物的穩(wěn)定性減弱，這兩個(gè)因素都表明在水溶液或膠束溶液中，RAA對BSA的熒光猝滅不是由分子間碰撞所引起的動(dòng)態(tài)熒光猝滅，而是RAA和BSA結(jié)合形成復(fù)合物而引起的靜態(tài)熒光猝滅。SVq

表1 溶液中主客體的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)（K）、散射碰撞猝滅速率常數(shù)（K）、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

圖2 298K時(shí)膠束溶液中大黃酸與BSA作用的Sterm-Volmer曲線

圖3 298K膠束溶液中大黃酸與BSA的雙對數(shù)曲線

2.3 大黃蒽醌類化合物與BSA作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)A

大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素對BSA熒光猝滅是兩者形成主客體復(fù)合物的靜態(tài)猝滅，即遵循Lineweaver-Burk方程：

其中：n為客體和BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，Ka為結(jié)合常數(shù)，以對ln［Dt］作圖（圖3）（r≥0.9950），即可獲得n值和Ka值（表1）。大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素3個(gè)客體與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，而復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)Ka＞104，其復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定。對于同一條件下，復(fù)合物的Ka，水＞Ka，膠束，這是因?yàn)锽SA的氨基酸殘基和客體都可以增溶于膠束的膠核內(nèi)，限制了主客體之間的結(jié)合；而膠束間存在的靜電排斥力，進(jìn)一步使得主客體間的結(jié)合更加困難，這二者的疊加使Ka，水＞Ka，膠束。C12-C4-C12和C16-C6-C16膠束溶液結(jié)構(gòu)及性質(zhì)基本相似，疏水鏈和鏈接基的長度對于復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)影響較小，因此Ka值變化較小。

圖4 蘆薈大黃素與BSA作用的同步熒光（a、c（Δλ＝60 nm），b、d（Δλ＝15 nm）；a、b-水溶液，c、d-C12-C4-C12）（［Alone-emodin］＝0，0.33 mol·L-1，0.67 mol·L-1，1.00 mol·L-1，1.33 mol·L-1，1.67 mol·L-1，2.00×10-5 mol·L-1，［BSA］＝2.50×10-6 mol·L-1，pH＝7.20，298 K）

依據(jù)Ross總結(jié)的小分子與生物大分子結(jié)合力的熱力學(xué)規(guī)律：△H＜0，△S＞0為靜電力；△H＜0，△S＜0為分子間力及氫鍵；△H＞0，△S＞0主要為疏水作用力［17］。根據(jù)所計(jì)算的主客體結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)（見表1），△G＜0，因此主客體間的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)過程；而△S＞0，△H＜0，可以認(rèn)為研究體系分子間主要作用為靜電力，同時(shí)客體分子有多個(gè)羥基或羧基，RAA可以和BSA間存在氫鍵作用。

2.4 RAA與BSA作用的同步熒光

在BSA濃度固定為2.5×10-6mol·L-1時(shí)，隨RAA濃度的增加，在最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度逐漸降低（圖4）。水溶液和膠束溶液中BSA的酪氨酸殘基的特征熒光譜圖的峰形由平緩變得尖銳，半峰寬分別為Δλ＝30 nm與Δλ＝16 nm，熒光強(qiáng)度ΔI水溶液≤ΔI膠束溶液，說明酪氨酸殘基增容于疏水性的膠核中，其親水性降低。而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長都在約280 nm，ΔIΔλ＝60nm＞ΔIΔλ＝15nm，說明BSA的熒光主要來源于色氨酸殘基，且色氨酸的特征熒光光譜的峰形在膠束溶液中變得尖銳，半峰寬也變窄，RAA-BSA-膠束形成了三元復(fù)合物。而色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低比酪氨酸殘基更顯著，說明RAA與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

2.5 結(jié)合距離

當(dāng)熒光主客體分子之間的距離≤7 nm，且其二者的熒光發(fā)射光譜與紫外吸收光譜存在較大的重疊時(shí)，根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，兩者之間即可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移［18］，其能量效率E、主客體間的能量轉(zhuǎn)移距離r及E＝50%時(shí)的臨界距離R0如下：

其中：K2為偶極空間取向因子，其值為2/3；N為介質(zhì)折射指數(shù)，其值為1.336；Φ為BSA熒光量子產(chǎn)率，其值為0.118，J為主客體熒光發(fā)射光譜與吸收光譜的重疊積分，E為［BSA］∶［RAA］＝1∶1時(shí)的能量效率。

不論是在水溶液中還是膠束溶液中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示主客體之間的熒光發(fā)射光譜與吸收光譜都有較大程度的重疊，如圖5～圖6所示，主客體之間的重疊積分J、臨界距離R0及能量轉(zhuǎn)移距離r見表2，表中數(shù)據(jù)顯示r均小于7 nm，符合能量轉(zhuǎn)移理論，說明在該研究實(shí)驗(yàn)條件下主客體間由于能量轉(zhuǎn)移使BSA熒光發(fā)生猝滅，而且r＞R0表明客體對BSA內(nèi)源熒光的猝滅以靜態(tài)猝滅為主。在膠束溶液中，客體都可以通過增溶作用或籠效應(yīng)存在于膠束中，形成的二元復(fù)合物的體積大于單一的客體分子的體積，其臨界距離R0及能量轉(zhuǎn)移距離r都有所增大，并且膠束體積越大，R0及r值越大，即R0（H2O）＜

R0（C12-C4-C12）＜R0（C16-C6-C16）。

表2 大黃蒽醌類化合物與BSA上氨基酸殘基間的距離r

圖5 BSA和大黃酸熒光發(fā)射光譜與紫外吸收光譜的重疊（［BSA］=［Rhein］=2.50×10-6 mol/L）

圖6 BSA和蘆薈大黃酸熒光發(fā)射光譜與紫外吸收光譜重疊（［BSA］=［Alone-emodinin］=2.50×10-6 mol/L）

3 結(jié)論

（1）RAA、BSA及膠束形成的三元復(fù)合物使體系的熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅，且研究體系分子間的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)過程，主要作用為靜電力和氫鍵。

（2）在所研究實(shí)驗(yàn)條件下，RAA與BSA的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。

（3）在所研究實(shí)驗(yàn)條件下，主客體間由于能量轉(zhuǎn)移使BS?A熒光發(fā)生猝滅，且客體對BSA內(nèi)源熒光的猝滅以靜態(tài)猝滅為主，膠束體積越大，R0及r值越大，即R0（H2O）＜R0（C12-C4-C12）＜R0（C16-C6-C16）。