一株血清5 型副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

鄧汝森，顏廣智，陳盛楠，張海龍，顧萬軍，黃良宗

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）可引起豬以漿液性、纖維蛋白性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的嚴(yán)重全身性疾病［1］，由該病原引起的疾病稱為革拉澤?。℅lasser’s disease）。HPS 只感染豬，可以影響2 周齡～4 月齡的豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，常見于5～8 周齡，感染高峰通常見于保育期的4～6 周，有些早在保育舍內(nèi)最初2 周時就開始出現(xiàn)，并一直持續(xù)到肥育期早期，發(fā)病率可達40%，嚴(yán)重時死亡率可達50%［2］。

2020 年3 月，廣東茂名某規(guī)模豬場的2 月齡保育豬突然發(fā)生散發(fā)性死亡，豬場共有保育豬510 頭，發(fā)病78 頭，死亡17 頭，發(fā)病率15.29%，病死率21.79%。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查分析、豬群臨床表現(xiàn)和病豬病理變化作出初步判斷，并對可疑病毒進行PCR 檢測，但未檢測到相關(guān)病毒；同時進行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和16S rRNA 基因測序分析，確定為副豬嗜血桿菌病，菌株命名為MM20200311，對分離菌株進行藥敏試驗，參考藥敏試驗結(jié)果對發(fā)病豬群進行治療，取得了良好的治療效果。

1 材料與方法

1.1 病料

從茂名市某規(guī)模豬場采集病豬肺臟、心臟、胸腔積液、脾臟和腦。

1.2 主要試劑

感受態(tài)細(xì)胞DH5α，由本實驗室保存；蛋白酶K 購自大連寶生物工程有限公司；DNA Marker DL2000、PCR 擴增試劑盒、PMD-18T 載體、瓊脂糖購自TaKaRa 公司；DNA 膠回收試劑盒（D6902-01）購自美國齊特科公司；藥敏紙片購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；新型微生物微量生化鑒定管購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通血平板、含V 因子血平板、普通營養(yǎng)肉湯和含V 因子營養(yǎng)肉湯均由本實驗室配制。

1.3 病豬解剖觀察

剖檢病死豬，觀察內(nèi)臟的病理變化，并拍照記錄。

1.4 病毒檢測

進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒、豬流感病毒和豬瘟病毒PCR 檢測。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集豬肺臟、心臟、胸腔積液、脾臟和腦病料，分別接種于含NAD 鮮血培養(yǎng)基，置于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24～48 h 后觀察結(jié)果，然后再進一步純培養(yǎng)。從NAD 鮮血平板上挑取可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色，進行細(xì)菌形態(tài)特征觀察。將疑似HPS 菌落的純培養(yǎng)物分別接種于麥康凱培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、巧克力培養(yǎng)基、普通血平板和含V 因子的血平板，觀察細(xì)菌生長狀況。

1.6 衛(wèi)星現(xiàn)象試驗

在普通營養(yǎng)瓊脂平板分別均勻劃線致密接種可疑菌株，同時在平板的中心平行劃線接種兩行金黃色葡萄球菌，置5%二氧化碳培養(yǎng)箱，于37 ℃條件下培養(yǎng)24～4 h，觀察細(xì)菌生長狀況［3］。

1.7 V 因子依賴性試驗

將分離菌株純培養(yǎng)物分別接種到普通營養(yǎng)肉湯和含V 因子營養(yǎng)肉湯，觀察肉湯的渾濁度。

1.8 生化鑒定

將HPS 可疑菌株純培養(yǎng)物接種生化微量鑒定管，生化微量鑒定管中同時加入5 μL 0.07%的V 因子，置于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

1.9 分離菌16S rRNA 基因序列分析

根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA（M75065）序列設(shè)計引物［4］，上游引物：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’；下游引物：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’，16S rRNA PCR 擴增產(chǎn)物預(yù)期大小為822 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用水煮法提取分離菌株的基因組DNA，以提取的DNA 為模板，用16S rRNA 基因特異性引物進行PCR 擴增，隨后對PCR 產(chǎn)物進行膠回收純化，純化PCR 產(chǎn)物連接PMD-18T 載體后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿，挑取5 個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，對測序結(jié)果做同源性分析。

1.10 副豬嗜血桿菌血清型分子分型

副豬嗜血桿菌血清型分型引物參照文獻［3］進行設(shè)計，引物序列見表1。對分離菌進行PCR 血清型鑒定，反應(yīng)體系為25 μL:2×premix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板3 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，64 ℃30 s，72 ℃60 s，共30 個循環(huán)；72 ℃5min。

表1 血清型鑒定PCR 引物序列

續(xù)表

1.11 血清凝集試驗

取上述1.5 中純化培養(yǎng)的菌落用無菌PBS 混勻作為待檢菌液，分別取5 型、12 型和7 型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清50 μL 與50 μL 菌液進行凝集試驗［5］，以待檢菌液作為陰性對照，對分離菌株進行血清型鑒定。

1.12 藥敏試驗

挑取單菌落接種于含V 因子營養(yǎng)肉湯中，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～6 h，取100 μL 均勻涂布于含V 因子血平板上［6］。用紙片瓊脂擴散法（K-B 法）［7］進行藥敏試驗，選取氧氟沙星、頭孢拉定等20 種常用抗生素為試驗藥物。于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑并參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥（R）、敏感（S）或中介（I）進行結(jié)果判斷與耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 死亡豬的病理剖檢

發(fā)病豬群臨床表現(xiàn)為采食量下降，體溫升高，嚴(yán)重者呼吸困難，個別伴有咳嗽，關(guān)節(jié)腫大，身體震顫。解剖病豬發(fā)現(xiàn)，呼吸困難的仔豬可見其肺臟有大量纖維性析出，胸腔積液，個別病豬有心包積液，且心包發(fā)生粘連，慢性發(fā)病豬呈現(xiàn)絨毛心；剖開腫脹關(guān)節(jié)有大量清亮液體流出。

2.2 病毒檢測

未檢測到相關(guān)病毒。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

疑似HPS 感染的豬病料接種于V 因子血平板，出現(xiàn)白色、半透明、細(xì)小露珠狀菌落（見圖1a），從中分離到1 株可疑菌株，分離菌株鏡下形態(tài)都相似，均為革蘭陰性短小桿菌，無芽胞，多呈散在排列，菌體細(xì)?。ㄒ妶D1b）。分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基上均不生長；在巧克力培養(yǎng)基和普通血平板上生長緩慢；在V 因子血平板上生長良好，長成白色半透明細(xì)小露珠狀菌落，邊緣整齊、光滑、圓形隆起，菌落直徑約0.5～1 mm，具反光特性，均不溶血。

圖1 分離菌菌落和菌體形態(tài)

2.4 衛(wèi)星試驗結(jié)果

衛(wèi)星現(xiàn)象試驗可觀察到越接近葡萄球菌，分離菌形成的菌落越大、越多，離葡萄球菌越遠，菌落越小，甚至不生長（見圖2）。

2.5 V 因子依賴性試驗結(jié)果

分離菌株在1 號和2 號普通營養(yǎng)肉湯中未見生長，肉湯清亮，而在V 因子營養(yǎng)肉湯中生長良好，肉湯十分渾濁（見圖2），說明該分離菌對V 因子存在一定的依賴性。

圖2 衛(wèi)星生長現(xiàn)象和V 因子依賴性試驗

2.6 生化特性試驗

把分離菌株接種在含V 因子的生化微量鑒定管，置于5%的二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h 后，其生化特性表明該分離菌能分解蔗糖、棉子糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、尿素及七葉苷，而其不分解阿拉伯糖、苯丙氨酸、硫化氫、甘露糖、葡磷胨水、半乳糖、側(cè)金盞花醇。精氨酸脫羧酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗及靛基質(zhì)試驗陰性。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，以上生化鑒定結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的生化特征。

2.7 16S rRNA 基因序列分析

以分離菌株的DNA 為模板，用16S rRNA 基因特異性引物進行PCR 擴增，在約822 bp 位置可見清晰條帶，與陽性對照一致，陰性對照在相應(yīng)位置未見條帶（見圖3）。把16S rRNA 基因測序結(jié)果與GenBank 中登錄的副豬嗜血桿菌參考菌株序列進行同源性比對，分離菌與副豬嗜血桿菌同源性＞99%，發(fā)育進化樹顯示分離菌株與副豬嗜血桿菌HS1080 株處于同一分支（見圖4），表明分離株為副豬嗜血桿菌，命名為MM20200311。

圖3 HPS-16S rRNA PCR 鑒定和HPS 血清型鑒定

圖4 分離菌株與參考株16S rRNA 序列系統(tǒng)進化樹

2.8 分離菌血清型鑒定

利用HPS 血清分型引物對分離菌進行血清型分型，結(jié)果見圖3，在500 bp 左右出現(xiàn)特異性條帶，由此推測分離菌MM20200311 可能為5 型或12 型HPS。因此，利用HPS 的5 型和12 型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進一步驗證，結(jié)果表明只有5 型標(biāo)準(zhǔn)血清與待檢菌液發(fā)生凝集反應(yīng)，說明本次試驗分離出一株血清型5型HPS。

2.9 藥敏試驗結(jié)果

從表2 可見，分離菌MM20200311 對頭孢唑啉、頭孢拉定、奧格門丁、慶大霉素、氟哌酸、頭孢喹肟、氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素、紅霉素、氟苯尼考高度敏感；對氧氟沙星、諾氟沙星、阿米卡星、多西環(huán)素、鏈霉素、金霉素、甲氧芐啶、利福平耐藥。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

通過流行病學(xué)調(diào)查、豬群臨床表現(xiàn)、病豬剖檢分析、病毒檢測、細(xì)菌分離鑒定及最終豬群用藥效果，初步確定引起該豬場本次疾病的病原為5 型副豬嗜血桿菌。經(jīng)了解，該批豬群在發(fā)病前1 周從外地購苗轉(zhuǎn)入，之后陸陸續(xù)續(xù)有豬出現(xiàn)低燒、少吃，注射氟尼辛普甲胺注射液后仍未見好轉(zhuǎn)。發(fā)病第3 天出現(xiàn)個別豬只死亡，病死豬表面多部位出現(xiàn)發(fā)紺癥狀，尤其在耳后、腹部及四肢內(nèi)側(cè)等部位表現(xiàn)明顯?，F(xiàn)場發(fā)現(xiàn)該豬場保育豬舍內(nèi)地面濕滑，豬只密度較大，空氣悶熱，通風(fēng)條件較差，導(dǎo)致氨氣味較濃，偶爾有豬只間歇性咳嗽，聲音低沉。仔細(xì)觀察發(fā)病豬群，發(fā)病豬精神狀況欠佳，個別發(fā)病豬有松毛現(xiàn)象，長期趴地上，不愿站立，嚴(yán)重者關(guān)節(jié)腫大，肌肉震顫，后肢共濟失調(diào)，觸碰發(fā)出慘叫聲。

解剖病豬可見氣管黏膜充血，嚴(yán)重的帶有淡紅色泡沫；肺門淋巴結(jié)腫大出血；病豬心外膜有纖維蛋白析出，形成一層絨毛性假膜，可明顯看到心包積液增多，新冠脂肪呈膠凍狀，心內(nèi)膜有少量出血點；腹腔臟器與腹壁，心臟及肝臟與胸壁發(fā)生黏連。無菌操作采集肺臟、心臟、胸腔積液、脾臟和腦，低溫保存送檢。

從上述臨床癥狀及發(fā)病特征初步判斷本次疫情可能由細(xì)菌感染引起，將以上送檢病料進行細(xì)菌分離培養(yǎng)，分離出一株可疑菌株，經(jīng)革蘭染色鏡檢、生理生化鑒定、16S rRNA 基因克隆測序分析及血清型鑒定，最終確定分離菌株MM20200311 為5 型副豬嗜血桿菌。對該分離菌株進行藥敏試驗，結(jié)果顯示分離株對頭孢拉定、氨芐西林、大觀霉素、氟苯尼考等藥物高度敏感，而對磺胺類藥物嚴(yán)重耐藥，可能與臨床長期使用磺胺類藥物有較大關(guān)系，也可能由于副豬嗜血桿菌的耐藥機制發(fā)生改變而引起耐藥性。因此，在發(fā)生該病時應(yīng)該合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產(chǎn)生，提高治療效果。

本豬場推薦使用氟苯尼考進行肌肉注射，飲水添加復(fù)合維生素，連用3 天；另外每天早晚使用過硫酸氫鉀以1：100 的濃度進行場地消毒；加強通風(fēng)，地面保持干爽；把病情嚴(yán)重的保育豬單獨隔離治療。用藥第2 天，整體豬群精神狀態(tài)有較大好轉(zhuǎn)，采食量明顯恢復(fù)，有2 頭保育豬因病情過長衰弱死亡。直到第4 天，全場保育豬恢復(fù)穩(wěn)定，疫情得到了控制，整體治療效果較為滿意。

目前對于副豬嗜血桿菌的防控應(yīng)從飼養(yǎng)管理做起，堅持自繁自養(yǎng)、全進全出的飼養(yǎng)模式，盡可能減少應(yīng)激（如斷奶、轉(zhuǎn)群、飼料更替、潮濕、氣溫驟變等），以達到控制該病的目的。豬場中一旦發(fā)現(xiàn)該病，應(yīng)立刻進行藥敏試驗，選取敏感藥物及時治療或用本場分離的菌株制成滅活疫苗及時做好免疫接種；日?？蛇x用中藥保健，以提高豬群整體免疫力［8］。