醒脾解郁湯對(duì)七氟醚麻醉后老年小鼠記憶功能的影響*

高源，李秀菊，趙雪，宗傳赪，王領(lǐng)

(武漢市第八醫(yī)院麻醉科，武漢 430010)

七氟醚是一種臨床常用吸入性全身麻醉藥物，具有誘導(dǎo)快、蘇醒迅速、理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但臨床研究卻發(fā)現(xiàn)七氟醚可導(dǎo)致患者，尤其是老年患者出現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)，其主要表現(xiàn)為麻醉術(shù)后出現(xiàn)記憶力減退、執(zhí)行力受損、定向力障礙以及抽象思維障礙等，對(duì)患者術(shù)后康復(fù)以及生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1-2]。七氟醚引起POCD發(fā)生的相關(guān)機(jī)制尚未明確，臨床上也缺乏有效的防治手段。醒脾解郁湯由石菖蒲、西洋參、熟地黃、郁金等常用于治療認(rèn)知障礙的中藥制成[3-4]，前期研究發(fā)現(xiàn)醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能障礙和神經(jīng)元損傷具有較好的緩解作用[5]，提示醒脾解郁湯在認(rèn)知障礙相關(guān)疾病中具有較大的潛在價(jià)值。筆者在本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察醒脾解郁湯對(duì)七氟醚麻醉后老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為和細(xì)胞炎性因子水平的影響，探討醒脾解郁湯影響術(shù)后認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6J小鼠40只，18個(gè)月齡，雌雄各半，體質(zhì)量30～35 g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0019；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NO.42816300002591。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定，所有小鼠于溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，人工光照明暗各12 h的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2試藥 石菖蒲(批號(hào)：20161103)、西洋參(批號(hào)：20161101)、郁金(批號(hào)：20161102)和熟地黃(批號(hào)：20161101)購(gòu)自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。醒脾解郁湯組成[6]：取石菖蒲10 g，西洋參15 g，郁金12 g和熟地黃15 g放入容器中，加水并淹沒(méi)至藥材上1 cm處，浸泡30 min，先武火煮至沸騰，再文火煮30 min后倒出，即制成生藥含量為0.26 g·mL-1的醒脾解郁湯。七氟醚(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：H20160706)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所(貨號(hào)分別為：A003-1、A001-1、A005、A013-2)。白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-2、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自貝茵萊公司(貨號(hào)分別為MU30386、MU30009、MU30044、MU30030)。兔抗caspase 3多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)分別為ab4051、ab182733、ab196495)；兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司(貨號(hào)：10494-1-AP)。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：DNM-9602)；電泳儀(Bio-Rad公司，型號(hào)：mini protean 3 cell)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon-5200)。

1.4動(dòng)物分組、給藥 將小鼠按照數(shù)字隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，醒脾解郁湯小、中和大劑量組，每組8只。正常對(duì)照組小鼠吸入氧氣(30%)和氮?dú)?70%)的混合氣體6 h；模型對(duì)照組小鼠吸入2.6%七氟醚、30%氧氣和67.4%氮?dú)獾幕旌蠚怏w6 h；醒脾解郁湯小、中和大劑量組小鼠于七氟醚處理前6 d開(kāi)始至處理后第2天，每天灌服醒脾解郁湯3.6，7.2，14.4 g·kg-1·d-1。

1.5水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]。訓(xùn)練期前檢測(cè)各組小鼠游泳速度以及逃逸潛伏期，各組間小鼠無(wú)明顯差異情況下進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。所有小鼠于吸入氣體前6 d開(kāi)始進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，每日4次。每次將小鼠面向池壁入水，令其尋找置于第Ⅰ象限水面下1 cm處平臺(tái)，所耗時(shí)間記為逃逸潛伏期。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定最大時(shí)限為90 s(即在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)者停止記錄，并將逃逸潛伏期記為90 s)。七氟醚處理后第2天撤去平臺(tái)，選取原平臺(tái)正對(duì)象限為動(dòng)物入水點(diǎn)，讓動(dòng)物自由游泳90 s，記錄90 s內(nèi)動(dòng)物穿過(guò)平臺(tái)區(qū)的次數(shù)，并記錄逃逸潛伏期和在原平臺(tái)停留的時(shí)間。水迷宮測(cè)定完畢后，立即腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，麻醉小鼠后迅速處死，收集各組小鼠腦組織樣本，分離海馬及大腦皮層，保存于-80 ℃中備用。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 將收集的海馬及大腦皮層組織剪碎，按照1：5比例加入組織樣本和預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在冰上進(jìn)行勻漿，5000 r·min-1離心5 min(有效離心半徑為85 mm)，取上清液檢測(cè)SOD、MDA及GSH-PX表達(dá)變化，生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NO含量，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7炎癥因子檢測(cè) 取小鼠海馬及大腦皮質(zhì)組織，勻漿上清液，ELISA檢測(cè)各組小鼠海馬和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的表達(dá)。具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8Western blotting檢測(cè) 取各組小鼠海馬組織，采用RIPA裂解液提取組織蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣蛋白樣品30 μL，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，使用5%脫脂奶粉進(jìn)行室溫封閉1 h，經(jīng)TBST洗滌后分別加入一抗(Bax、Bcl-2和caspase-3)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST再次洗滌后，加入特異性二抗IgG，進(jìn)行室溫孵育1 h，洗膜，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑對(duì)其曝光顯影，拍照保存。

2 結(jié)果

2.1小鼠記憶功能的影響 水迷宮訓(xùn)練前，各組小鼠游泳速度及逃逸潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。水迷宮測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表2，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及在該象限停留的時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組逃逸潛伏期顯著縮短，小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)和在該象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，醒脾解郁湯大劑量組逃逸潛伏期時(shí)間最短，穿越平臺(tái)次數(shù)最多及在該象限停留的時(shí)間最長(zhǎng)。

表1 5組小鼠訓(xùn)練前游泳速度及逃逸潛伏期比較

表2 5組老年小鼠記憶功能檢測(cè)值

2.2小鼠氧化應(yīng)激的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量均顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量均顯著升高(均P<0.05)，MDA含量顯著降低(均P<0.05)。見(jiàn)表3，表4。

表3 5組小鼠海馬組織中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

表4 5組小鼠大腦皮層中SOD、MDA、GSH-PX和NO的含量

2.3小鼠炎癥因子的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(均P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表5和表6。

表5 5組小鼠海馬組織中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.5 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in hippocampus of five groups of mice

表5 5組小鼠海馬組織中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

組別IL-17AIL-2正常對(duì)照組101.68±10.39175.25±21.96模型對(duì)照組310.57±24.68①373.24±26.99①醒脾解郁湯 小劑量組263.44±11.10②316.07±12.60② 中劑量組237.89±13.86②281.31±20.96② 大劑量組191.01±9.52②③243.93±9.89②③F68.69459.381P<0.05<0.05組別IL-6 TNF-α正常對(duì)照組79.62±6.8980.03±7.22模型對(duì)照組166.65±7.48①248.97±30.76①醒脾解郁湯 小劑量組149.03±6.96②201.87±10.77② 中劑量組133.05±6.70②175.39±6.05② 大劑量組110.91±6.62②③151.64±6.04②③F81.51742.944P<0.05<0.05

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

表6 5組小鼠大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

Tab.6 Contents of IL-17A，IL-2，IL-6 and TNF-α in cerebral cortex of five groups of mice

表6 5組小鼠大腦皮質(zhì)中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的含量

組別IL-17AIL-2正常對(duì)照組99.40±7.99185.50±22.56模型對(duì)照組314.90±21.05①371.70±30.83①醒脾解郁湯 小劑量組269.11±10.92②324.21±15.56② 中劑量組230.12±8.02②286.17±11.34② 大劑量組203.30±13.94②③235.65±15.48②③F80.44559.694P<0.05<0.05組別IL-6TNF-α正常對(duì)照組87.65±10.4974.03±8.30模型對(duì)照組167.43±6.63①232.55±16.48①醒脾解郁湯 小劑量組146.82±6.25②196.55±8.39② 中劑量組130.86±6.80②182.42±12.22② 大劑量組116.56±5.01②③150.94±8.83②③F86.53156.303P<0.05<0.05

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05； ②Compared with model control group，P<0.05； ③Compared with low-dose Xingpi Jieyu decoction group，P<0.05.

2.4老年小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blotting 結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，醒脾解郁湯小、中、大劑量組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著降低(F=81.434，63.449，均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(F=80.352，P<0.05)，且呈劑量依賴(lài)性。

3 討論

在全身麻醉手術(shù)中，POCD是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，患者會(huì)出現(xiàn)記憶損害以及學(xué)習(xí)困難等主要臨床特征，POCD一般會(huì)持續(xù)>2周，嚴(yán)重者甚至可導(dǎo)致不可逆的進(jìn)行性認(rèn)知功能減退[8-9]。已有研究證實(shí)，POCD發(fā)病的最重要危險(xiǎn)因素之一是全身麻醉藥物的使用[1，10]。七氟醚作為臨床使用最頻繁的吸入性全身麻醉藥物，可顯著增加老年患者POCD的發(fā)病率，且七氟醚的暴露劑量與POCD患者認(rèn)知功能下降的程度具有相關(guān)性[11]。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評(píng)估嚙齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的重要工具，受試動(dòng)物根據(jù)迷宮周?chē)膮⒄瘴飦?lái)確定平臺(tái)的位置，是一種以異我為參照的認(rèn)知過(guò)程[7]。本研究借助Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)七氟醚可顯著損害老年小鼠的記憶能力以及視空間學(xué)習(xí)能力，其主要表現(xiàn)為逃逸潛伏期延長(zhǎng)、穿臺(tái)次數(shù)減少、平臺(tái)所在象限停留時(shí)間縮短，而醒脾解郁湯可有效改善七氟醚導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙，且呈劑量依賴(lài)性。

POCD的發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，目前認(rèn)為可能與麻醉手術(shù)導(dǎo)致的組織氧化應(yīng)激、炎癥因子過(guò)度釋放以及細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。七氟醚可誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞變性及凋亡[13]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)七氟醚導(dǎo)致麻醉后認(rèn)知障礙的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激有關(guān)[14]。氧自由基損傷可降低大腦學(xué)習(xí)記憶能力，自由基可激發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)分解終產(chǎn)物MDA通過(guò)交聯(lián)和結(jié)合形成脂褐素，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷，引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。而SOD、GSH-PX和NO則可以有效地清除自由基，發(fā)揮抗氧化作用，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)組織[15-16]。本研究結(jié)果顯示，醒脾解郁湯可顯著升高小鼠海馬組織和大腦皮質(zhì)中SOD、GSH-PX和NO含量，降低MDA含量，且呈劑量依賴(lài)性。這表明醒脾解郁湯正是通過(guò)發(fā)揮其抗氧化作用有效緩解七氟醚所導(dǎo)致的氧自由基對(duì)小鼠認(rèn)知功能的損傷。細(xì)胞炎癥因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的過(guò)度釋放所引起的記憶長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)抑制被認(rèn)為是導(dǎo)致動(dòng)物認(rèn)知功能損害的另一重要機(jī)制。細(xì)胞炎癥因子通?？烧T導(dǎo)谷氨酰胺神經(jīng)興奮毒性損傷、抑制海馬神經(jīng)元的發(fā)生、易化外周炎癥因子浸潤(rùn)及擴(kuò)大神經(jīng)系統(tǒng)級(jí)聯(lián)炎癥反應(yīng)等[17]。因此，抑制細(xì)胞炎癥因子IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α等的過(guò)度釋放對(duì)于預(yù)防和緩解術(shù)后認(rèn)知功能障礙至關(guān)重要。王椿野等[6]研究結(jié)果顯示醒脾解郁方可通過(guò)抑制抑郁模型大鼠血清以及海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的過(guò)度釋放來(lái)改善其學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果顯示醒脾解郁湯可顯著抑制小鼠海馬組織和大腦皮層中IL-17A、IL-2、IL-6和TNF-α的釋放，且呈劑量依賴(lài)性。這表明醒脾解郁湯通過(guò)抑制其炎癥因子的過(guò)度釋放有效緩解了七氟醚所導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能的損傷。研究表明，caspases家族在缺血性腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，caspases是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，caspase 3是下游最關(guān)鍵的凋亡調(diào)控蛋白，機(jī)體在正常情況下，caspase 3處于非活化的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，通過(guò)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)caspase切割并活化最終誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。Bax與Bcl-2均屬于Bcl-2家族，其分別具有促凋亡和抗凋亡作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示醒脾解郁湯可顯著抑制小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)，顯著升高Bcl-2蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。這表明醒脾解郁湯正是通過(guò)調(diào)控小鼠大腦細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)有效緩解七氟醚所導(dǎo)致的小鼠認(rèn)知功能的損傷。

1.正常對(duì)照組；2.模型對(duì)照組；3.醒脾解郁湯小劑量組；4.醒脾解郁湯中劑量組；5.醒脾解郁湯大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與醒脾解郁湯小劑量組比較，P<0.05。

綜上所述，醒脾解郁湯可通過(guò)其抗氧化作用、抑制炎癥因子的過(guò)度釋放以及調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)有效緩解七氟醚所致的小鼠認(rèn)知功能損傷，且呈劑量依賴(lài)性，但其是否還通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步更深入研究。