2型糖尿病伴肥胖患者解偶聯(lián)蛋白3基因及漿細(xì)胞膜蛋白-1基因的表達(dá)研究

吳 侃, 范曉利, 吳亞平, 張婧婧

(江蘇省南京市江寧醫(yī)院 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 211100)

研究[1]顯示，肥胖癥與遺傳、患者生活習(xí)慣、生活環(huán)境等均有一定的聯(lián)系。2型糖尿病(T2DM)患者合并肥胖可加重機(jī)體代謝紊亂，導(dǎo)致血壓異常、血脂異常等。解偶聯(lián)蛋白3(UCP3)是線粒體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可增加機(jī)體能量消耗，減輕體質(zhì)量[2]。漿細(xì)胞膜蛋白-1(PC-1)可有效結(jié)合胰島素受體而抑制受體信息傳導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生胰島素抵抗[3]。研究[4]顯示, PC-1基因編碼區(qū)外第4外顯子121位谷氨酰胺/賴氨酸多態(tài)性與機(jī)體肥胖、糖尿病等密切相關(guān)。本研究探討UCP3、PC-1基因多態(tài)性對T2DM伴肥胖患者預(yù)后的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院2018年6—12月120例T2DM伴肥胖患者(男58例，女62例)、120例T2DM非肥胖患者(男59例，女61例)、120例肥胖患者(男59例，女61例)、120例非T2DM非肥胖健康者(男60例，女60例)的臨床資料。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)，所有患者均自愿參與本研究。

納入標(biāo)準(zhǔn): ① T2DM伴肥胖患者符合糖尿病伴肥胖診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，包括空腹血糖≥7.0 mmol/L, 餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L, 體質(zhì)量指數(shù)為25～35 kg/m2; ② 患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重充血性心力衰竭患者; ② 合并惡性腫瘤、造血系統(tǒng)障礙等疾病者; ③ 有甲狀腺髓樣癌(MTC)既往史或家族史患者，以及2型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征患者; ④ 炎癥性腸病和糖尿病性胃輕癱患者; ⑤ 已知對鹽酸二甲雙胍和諾和力以及藥品中相關(guān)成份過敏者; ⑥ 嚴(yán)重肝、腎功能不全的患者; ⑦ 嚴(yán)重的感染和外傷的患者; ⑧ 不接受資料收集者。

1.2 方法

受試者采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)檢測UCP3Tyr210Tyr(C-T)多態(tài)性基因型及PC-1基因第4外顯子121位谷氨酰胺/賴氨酸多態(tài)性。取清晨空腹靜脈血4 mL, 加入枸櫞酸鈉抗凝劑混勻，室溫下高速離心，分離血漿與紅細(xì)胞層之間的白細(xì)胞層，保存于-80 ℃離心管中。加入4倍體積裂紅液混勻，高速離心后棄上清，重復(fù)至細(xì)胞團(tuán)呈粉色。加入8倍體積生理鹽水混勻，高速離心后棄上清，加入3 mL裂白液, 10 mg/mL蛋白酶E 200 μL, 10%SDS溶液400 μL, 混勻后37 ℃過夜。加入1/4體積飽和氯化鈉，顛倒混勻，離心20 min。取上清液置于試管中，加入2倍體積無水乙醇，輕搖至DNA析出，使用70%乙醇清洗2～3次，加入TE緩沖液，-20℃保存。

UCP3基因多態(tài)性分析: 提取患者外周血基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃變性12 min, 60 ℃下退火30 s, 95℃下變性30 s, 45個循環(huán)后，于72 ℃延伸10 min。PCR引物見表1。取靜脈血加入EDTA抗凝劑分離白細(xì)胞，抽取DNA。自PC-1基因第4外顯子序列加入緩沖液成分, 4種DNTP、上下游引物(PCR上游引物序列: 5′-ATGTGTTCACTTTGGACATGTTG-3′; 下游引物序列: 5′-GACGTTGGAAGATACCAGGTTG-3′), 94 ℃下5 min, 冰溶冷卻后加入DNA多聚酶，液體石蠟封頂，按照標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃下45 min, 72 ℃下退火45 s, 63 ℃下45 s, 35個循環(huán)后，于72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠分析。取鑒定后的擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1.0 (L的限制性內(nèi)切酶AvaⅡ, 37 ℃下4 h, 以2.5%瓊脂糖凝膠檢測酶切片段，以標(biāo)準(zhǔn)分子量片段檢測酶切產(chǎn)物分子量。測定患者腰臀比(WHR)、血壓、血清總膽固醇(TC)、空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2 hPG)。

表1 PCR引物及序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 UCP3及PC-1基因擴(kuò)增及酶切產(chǎn)物結(jié)果鑒定

UCP3Tyr210Tyr(C-T)多態(tài)性基因型檢測中DNA提取得到了436 bp的PCR產(chǎn)物，以AvaⅡ內(nèi)切酶進(jìn)行酶解反應(yīng)后，酶切后電泳帶型為50、184、202 bp。若427位核苷酸C突變?yōu)門，則有1個酶切位點(diǎn)將丟失，含C427T突變的純合子(TT)僅為2個條帶，即50、386 bp; 雜合子CT可見50、184、202、386 bp。PC-1基因第4外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜檢測結(jié)果顯示，產(chǎn)物分子量為238 bp。以AvaⅡ內(nèi)切酶進(jìn)行酶解反應(yīng)后，會產(chǎn)生Q、K這2個等位基因，QQ(148、90 bp)、QK(238、148、90 bp, 第1、2泳道)、KK(238 bp，單一條帶，第3、4泳道)這3種基因型。見圖1、2。

圖2 PC-1酶切電泳結(jié)果

2.2 UCP3及PC-1不同基因型臨床資料分布

UCP3Tyr210Tyr(C-T)多態(tài)性基因型檢測中，帶T的基因型組與CC基因型組臨床資料分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PC-1多態(tài)性基因型檢測中，帶Q的基因型組與KK基因型組BMI、平均收縮壓及舒張壓、TC、FBG、2 hPG比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 UCP3及PC-1不同基因型臨床資料分布

2.3 不同群體UCP3及PC-1等位基因頻率分布

T2DM伴肥胖組、T2DM非肥胖組、肥胖組以及非T2DM非肥胖健康組受試者UCP3等位基因中C與T分布頻率均較低，肥胖組、非T2DM非肥胖健康組PC-1等位基因中K等位基因頻率高于T2DM伴肥胖組、T2DM非肥胖組。見表3。

表3 不同組受試者UCP3及PC-1等位基因頻率分布[n(%)]

2.4 不同組受試者PC-1基因頻率比較

組間比較結(jié)果顯示，非T2DM非肥胖健康組與肥胖組(x2=6.452,RR=5.290,P=0.016)、T2DM非肥胖組(x2=4.658,RR=4.260,P=0.028)、T2DM伴肥胖組(x2=10.982,RR=9.280,P=0.002)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中T2DM伴肥胖群體具有PC-1 Q等位基因而肥胖的相對危險性是非糖尿病非肥胖群體的9.28倍。

3 討 論

肥胖可導(dǎo)致高血壓、高血脂、高尿酸等疾病，同時也是T2DM的危險因素。UCP3及PC-1等遺傳因子是近年來肥胖研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，其中UCP包括UCP1～UCP5基因，而UCP3基因主要在骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，對機(jī)體產(chǎn)熱有重要作用，是肥胖的候選基因，可介導(dǎo)氧化過程及二磷酸腺苷(ADP)磷酸化的解偶聯(lián)，促進(jìn)能量以熱能形式釋放。UCP3基因表達(dá)增高可有效降低活性氧產(chǎn)物，或通過降低細(xì)胞膜電壓等增加活性氧產(chǎn)生[6-9]。

CHA M H等[10]研究發(fā)現(xiàn), UCP3Tyr210Tyr(C-T)多態(tài)性基因型檢測中，基因型為TT的患者均表現(xiàn)為糖尿病，而血糖正常的患者無此種基因型。此結(jié)果提示UCP3基因多態(tài)性可能在糖尿病患者發(fā)病中有重要作用，可能會改變患者體脂組成，從而影響患者肥胖程度[11]。本研究結(jié)果顯示，UCP3Tyr210Tyr(C-T)多態(tài)性基因型檢測中，帶T的基因型組與CC基因型組臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 可能是不同種族對基因影響程度不同所致，或者是因?yàn)楸狙芯窟x取樣本量較少，未排除偏倚性、環(huán)境等因素影響。

研究[12-13]證實(shí), PC-1可有效抑制胰島素受體酪氨酸激酶(IRTK)因子，從而影響胰島素信號傳遞，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)糖尿病患者血糖、胰島素水平升高，因此PC-1對糖尿病患者的胰島素抵抗有重要作用。T2DM患者在胰島素信號傳導(dǎo)通路上的受體缺陷較正常人更明顯[14-15]。本研究結(jié)果顯示, PC-1多態(tài)性基因型檢測中，帶Q的基因型組與KK基因型組的體質(zhì)量指數(shù)、平均收縮壓及舒張壓、TC、FBG、2 hPG比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 肥胖組、非T2DM非肥胖健康組PC-1等位基因中K等位基因頻率高于T2DM伴肥胖組、T2DM非肥胖組。上述結(jié)果提示Q等位基因不僅與肥胖患者發(fā)病有一定關(guān)系，還可導(dǎo)致患者出現(xiàn)高血壓、高脂血癥等并發(fā)癥[16-17]。

本研究K、Q基因型頻率均經(jīng)遺傳平衡定律檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg平衡原則。非T2DM非肥胖健康組與肥胖組(x2=6.452,RR=5.290,P=0.016)、T2DM非肥胖組(x2=4.658,RR=4.260,P=0.028)、T2DM伴肥胖組(x2=10.982,RR=9.280,P=0.002)的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中T2DM伴肥胖群體具有PC-1 Q等位基因而肥胖的相對危險性是非糖尿病非肥胖群體的9.28倍。上述結(jié)果提示Q等位基因可能是患者的易感基因，即Q等位基因?qū)σ葝u素受體親和力更高，對胰島素受體信號傳遞抑制作用更強(qiáng)[18-19]。王毅等[20]研究表明, PC-1中Q等位基因?qū)σ葝u素敏感性破壞機(jī)制更強(qiáng)，患者胰島素抵抗進(jìn)展更快，與本研究結(jié)果一致。目前，臨床上對UCP3、PC-1基因研究較少，本研究將UCP3、PC-1作為T2DM伴肥胖患者的候選基因，進(jìn)一步研究將擴(kuò)大樣本量，分析基因多態(tài)性與病情的相關(guān)性，以便于臨床更深入地了解疾病發(fā)病機(jī)制，預(yù)測病情嚴(yán)重程度，達(dá)到早期防治效果。

綜上所述, UCP3基因與T2DM伴肥胖無相關(guān)性, PC-1基因中Q等位基因是胰島素抵抗的易感基因。因此，對T2DM伴肥胖家族史的人群進(jìn)行早期診斷，指導(dǎo)其改變生活方式，以改善患者預(yù)后。