微RNA在食管癌研究中的新進(jìn)展

劉燕群，邱世香，劉康，宋桂芹

(1.川北醫(yī)學(xué)院a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，b.醫(yī)學(xué)影像學(xué)院，c.第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.南充市中心醫(yī)院組織工程與干細(xì)胞研究所，四川 南充 637000)

食管癌是消化道最具侵襲性的腫瘤之一，2018年全球新發(fā)食管癌約57.2萬例，因食管癌死亡病例50.8萬，食管癌患病率居所有惡性腫瘤第7位，病死率居第6位，且存在顯著的地區(qū)差異，中國的食管癌發(fā)病率居第5位[1-2]。食管癌的病理類型分為腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，其中食管鱗狀細(xì)胞癌最常見。目前，食管癌的治療主要以手術(shù)切除為主，輔以多學(xué)科聯(lián)合治療，如放療、化療。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，分子靶向治療成為食管癌的二線治療方案[3]。然而，由于食管癌的早期診斷較困難，確診時多為中晚期，治療效果欠佳，食管癌患者的5年生存率僅為20%～30%[4]，其中腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者生存的主要因素。因此，了解食管癌發(fā)生的分子機(jī)制以及尋找新的分子標(biāo)志物，對于食管癌的預(yù)防和治療具有重要意義。

Guo等[5]首次發(fā)現(xiàn)，微RNA(microRNA，miRNA)在食管癌組織中存在差異表達(dá)譜。隨后多項研究證實(shí)，miRNA在食管癌中存在差異表達(dá)，并參與食管癌靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，通過負(fù)性調(diào)控靶基因降解其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或抑制其翻譯，進(jìn)而影響食管癌的增殖、遷移、侵襲及凋亡等生物功能，表明miRNA在食管癌早期臨床診斷、預(yù)后判斷以及基因治療方面具有較大的研究價值和發(fā)展前景。現(xiàn)對miRNA參與食管癌的形成、進(jìn)展及其作為潛在生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)的應(yīng)用予以綜述，以闡明miRNA對食管癌的發(fā)生發(fā)展以及對食管癌患者臨床診治的影響。

1 miRNA概述

miRNA是長度介于17～25個核苷酸長的單鏈非編碼RNA，在細(xì)胞核中miRNA編碼基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄本，初級轉(zhuǎn)錄本進(jìn)一步被Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白DGCR-8加工成約為70個核苷酸的莖環(huán)前體分子(前體miRNA)，這些前體分子通過核轉(zhuǎn)運(yùn)受體5和核蛋白Ran-GTP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，再經(jīng)RNA內(nèi)切酶Dicer酶切生成成熟miRNA，調(diào)控基因表達(dá)導(dǎo)致信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解或翻譯抑制[6]，見圖1。

Nucleus:細(xì)胞核；Cytoplasm：細(xì)胞質(zhì)；Pri-miRNA：初級轉(zhuǎn)錄本；Pre-miRNA：前體微RNA；RNA pol Ⅱ：RNA聚合酶Ⅱ；Ran-GTP：核蛋白；Exportin-5：核轉(zhuǎn)運(yùn)受體5；Dicer：RNA內(nèi)切酶；miRNA-miRNA duplex：微RNA復(fù)合物；RISC：RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體；mRNA Degradation：信使RNA降解；Translational repression：翻譯抑制；miRNA：微RNA

miRNA可以通過堿基配對的方式調(diào)控目標(biāo)mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯等過程。在植物中，成熟miRNA與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)的全部堿基配對，而哺乳動物中，成熟miRNA僅與目標(biāo)mRNA的3′非翻譯區(qū)的部分堿基配對[7]，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的表達(dá)減少或加速降解。miRNA在惡性腫瘤中的異常表達(dá)有多種機(jī)制，主要包括擴(kuò)增、缺失和突變、表觀遺傳沉默，并可根據(jù)作用靶點(diǎn)的不同，發(fā)揮致癌或抑癌作用。多項研究表明，上調(diào)的miRNA一般作為癌基因，通過負(fù)性調(diào)控作用對一個或多個抑癌基因產(chǎn)生抑制作用，起到促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用；而下調(diào)的miRNA一般作為抑癌基因，通過負(fù)性調(diào)控相應(yīng)癌基因抑制癌基因的表達(dá)，從而減緩腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[8-33]。

2 miRNA參與食管癌的發(fā)生與發(fā)展

2.1食管癌中異常表達(dá)的miRNA 近年來，隨著基因測序和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，對miRNA在食管癌中作用研究的不斷深入，越來越多的miRNA在食管癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)異常被發(fā)現(xiàn)。多項研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌中miRNA的異常表達(dá)主要以下調(diào)為主，miRNA通過降解靶基因或抑制其表達(dá)等負(fù)性調(diào)控手段干擾食管癌的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為[6,8-33]。此外，食管癌中也有表達(dá)上調(diào)的miRNA，且通常對相應(yīng)靶基因也起負(fù)性調(diào)控作用，通常作為癌基因，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制其凋亡。這些表達(dá)異常的miRNA對食管癌的作用多樣，通過不同靶點(diǎn)、不同信號通路影響食管癌細(xì)胞的增殖、周期、凋亡、侵襲、遷移以及臨床診斷和治療等。食管癌中異常表達(dá)的miRNA、分子靶標(biāo)及其生物學(xué)功能，見表1。

表1 食管癌中miRNA的異常表達(dá)情況

2.2miRNA的表達(dá)影響食管癌細(xì)胞的增殖和周期 細(xì)胞周期是一個復(fù)雜的過程，需要細(xì)胞周期蛋白的協(xié)調(diào)表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白依賴激酶及其調(diào)節(jié)因子的順序激活[34]。miRNA參與了食管癌細(xì)胞中編碼細(xì)胞周期蛋白的mRNA的調(diào)控，并可影響細(xì)胞周期進(jìn)展。Ma[12]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織和細(xì)胞中的miR-219-5P表達(dá)量明顯低于正常組織和細(xì)胞，且腫瘤組織和細(xì)胞中的miR-219-5P通過反向調(diào)控細(xì)胞周期素A2，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p、miR-27a、miR-107在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，分別靶向白細(xì)胞介素-11、熱激蛋白90、細(xì)胞分裂周期蛋白42，誘導(dǎo)食管癌周期阻滯在G1期，抑制食管癌細(xì)胞增殖[16,29,35-36]。miR-130b、miR-21、miR-10b在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，通過反向調(diào)控靶基因的表達(dá)起到促癌作用，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖[32,37-38]?？梢?，隨著miRNA研究的深入，更多影響食管癌增殖和周期的miRNA將會被鑒定出，從而為食管癌的靶向治療和早期診斷提供堅實(shí)的研究基礎(chǔ)。

2.3miRNA的表達(dá)影響食管癌細(xì)胞的凋亡 細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一系列基因激活、表達(dá)及調(diào)控等的作用，常見的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的通路有線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路以及死亡受體通路，而參與其中的Bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶蛋白家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因素，可激活細(xì)胞凋亡程序或釋放促凋亡因子，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[39]。在食管癌中異常表達(dá)的miRNA，一方面可通過影響B(tài)cl-2家族成員的表達(dá)促進(jìn)或抑制食管癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，另一方面可通過增強(qiáng)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Zheng等[40]發(fā)現(xiàn)，miR-145在食管癌組織和細(xì)胞中下調(diào)，調(diào)控靶基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3表達(dá)上調(diào)，在食管癌細(xì)胞中，過表達(dá)miR-145或敲低絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3，細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2水平均降低，促凋亡Bcl-2相關(guān)X蛋白水平升高，促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡，且食管癌中過表達(dá)的miR-145使DNA定向聚合酶ζ催化亞基的表達(dá)以及蛋白水平明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致Bcl-2表達(dá)水平降低，Bcl-2相關(guān)X蛋白和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡增加[15]。同樣，在食管癌細(xì)胞中，結(jié)構(gòu)蛋白家族成員1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了食管癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，過表達(dá)的miR-216a-5p抑制了結(jié)構(gòu)蛋白家族成員1的表達(dá)，導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低，促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)死亡啟動子水平升高，促進(jìn)了食管癌細(xì)胞的凋亡[13]。此外，miR-136、miR-27a在食管癌細(xì)胞中低表達(dá)，靶基因黏蛋白1和熱激蛋白90在食管癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)的miRNA可負(fù)性調(diào)控靶基因，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性，促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡[8,24]。miR-519在食管癌細(xì)胞中低表達(dá)，而過表達(dá)的miR-519使線粒體凋亡通路磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號途徑失活，使磷酸化的蛋白激酶B和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達(dá)減少[41]。各種miRNA對食管癌細(xì)胞凋亡作用的影響機(jī)制各不相同，但目前已知的對食管癌細(xì)胞凋亡有影響的miRNA十分有限，還需要更多研究進(jìn)一步闡明miRNA對食管癌細(xì)胞凋亡作用的調(diào)控機(jī)制。

2.4miRNA的表達(dá)影響食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移 食管癌是一種侵襲能力很強(qiáng)的腫瘤，其侵襲和遷移的能力與食管癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中miRNA的特異性表達(dá)與食管癌的侵襲遷移密切相關(guān)，可在不同程度上調(diào)控食管癌細(xì)胞的侵襲遷移能力[42]。一方面，原發(fā)性腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，獲得侵襲和轉(zhuǎn)移的特性，其特征主要為增強(qiáng)細(xì)胞間黏附上皮鈣黏素減少，間充質(zhì)細(xì)胞的分子標(biāo)記波形蛋白和神經(jīng)鈣黏素增加，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附減少或丟失，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周圍組織和器官的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[43]。Zeng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)作為多種轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療靶點(diǎn)在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，miR-133b在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)的miR-133b可直接靶向抑制EGFR的表達(dá)，進(jìn)而使上皮相關(guān)蛋白CK-18和上皮鈣黏素的表達(dá)增加、間葉相關(guān)蛋白(波形蛋白和神經(jīng)鈣黏素)的表達(dá)減少，抑制食管癌細(xì)胞EMT過程和食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移。有報道稱，蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2通過結(jié)合其基因啟動子上的E框抑制上皮鈣黏素基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，激活腫瘤的EMT過程[43]。在食管癌組織和細(xì)胞中，蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2表達(dá)上調(diào)，miR-429低表達(dá)，而過表達(dá)的miR-429可抑制靶基因蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2的表達(dá)，引起上皮相關(guān)蛋白上皮鈣黏素、β聯(lián)蛋白增加，間葉相關(guān)蛋白神經(jīng)鈣黏素、Snail減少，抑制食管癌的EMT過程和遷移[10]。同樣，在食管癌細(xì)胞中，過表達(dá)的miR-196、miR-4234也可負(fù)向調(diào)控靶基因的表達(dá)，增加上皮相關(guān)蛋白表達(dá)，減少間葉相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制食管癌的EMT進(jìn)展和遷移[31,44]。另外，Xie等[45]研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細(xì)胞中miR-1275通過靶向Wnt家族成員1，使Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路失活，抑制食管癌細(xì)胞的EMT過程和遷移。另一方面，基質(zhì)金屬蛋白酶家族的蛋白水解酶對細(xì)胞外基質(zhì)的重塑至關(guān)重要，其降解是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的先決條件。Zhou等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在食管癌中低表達(dá)，而miR-34a過表達(dá)可反向抑制靶基因叉頭框蛋白M1的表達(dá)，降低基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)水平，抑制食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲?？梢?，多種miRNA參與了食管癌細(xì)胞的EMT過程和侵襲遷移的調(diào)控，對miRNA的研究有助于了解食管癌的發(fā)展機(jī)制，并為臨床食管癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究提供新方向。

3 miRNA在食管癌臨床診療中的潛在價值

3.1miRNA在食管癌輔助診斷中的潛在作用 早期診斷食管癌可有效提高患者的生存率，但食管癌缺乏典型的臨床表現(xiàn)，而目前食管癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”——食管鏡下活組織病理檢查具有一定的侵入性，患者確診時大多為中晚期，嚴(yán)重影響了患者的臨床治療和生活質(zhì)量。近年來，隨著miRNA的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)部分miRNA可作為診斷食管癌的特異性血清學(xué)檢測指標(biāo)。Li等[18]比較114例食管癌患者和50名健康者的血清miR-29C水平發(fā)現(xiàn)，食管癌患者miR-29C的表達(dá)水平明顯低于健康人群，與miR-29C低表達(dá)者相比，miR-29C高表達(dá)者的生存時間更長。此外，與健康人群相比，食管癌患者血清miR-338-5p、miR-27a的表達(dá)水平明顯降低，且miR-338-5p的表達(dá)水平與較差的生存率以及5-氟尿嘧啶/順鉑新輔助化療的不良反應(yīng)相關(guān)[23-24]。由此可見，miRNA有望成為輔助食管癌診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

3.2miRNA在食管癌輔助治療中的作用 目前，食管癌的主要臨床治療方式仍為手術(shù)治療，同時化療和放療也是臨床治療食管癌的重要方式，臨床的化療藥物主要有5-氟尿嘧啶和順鉑等，但耐藥性限制了這些藥物的臨床應(yīng)用。近年來，隨著對食管癌治療的耐藥機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)與臨床化療耐藥相關(guān)[46]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-145、miR-29C、miR-338-5p在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，可分別反向調(diào)控相應(yīng)靶mRNA表達(dá)，而過表達(dá)miRNA將增強(qiáng)5-氟尿嘧啶對食管癌治療的敏感性，提高患者的總體生存率，抑制食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡[15,18,23]。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-544在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，E2F轉(zhuǎn)錄因子5作為其靶點(diǎn)在食管癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。miR-544可反向調(diào)控靶基因E2F轉(zhuǎn)錄因子5，抑制其表達(dá)，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，抑制食管癌細(xì)胞的增殖，有望成為食管癌治療的潛在靶點(diǎn)。同樣，Zheng等[40]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145通過直接抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)順鉑對食管癌治療的敏感性。

放療也是臨床常用治療方式之一，但腫瘤常存在內(nèi)在抗輻射性，miRNA可參與調(diào)控靶基因，以增強(qiáng)其抗腫瘤輻射的敏感性。Wang等[24]發(fā)現(xiàn)，miR-27a在食管癌組織中低表達(dá)，過表達(dá)miR-27a將抑制熱激蛋白90表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞增殖，輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，增強(qiáng)輻射治療食管癌細(xì)胞的敏感性。同樣，Zhang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，miR-519在食管癌細(xì)胞中低表達(dá)，并與患者總體預(yù)后生存不良相關(guān)，過表達(dá)miR-519導(dǎo)致磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路失活，增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對放療的敏感性?？梢姡喾NmiRNA可增強(qiáng)抗腫瘤藥物的敏感性以及放療的敏感性，有望輔助腫瘤的臨床治療，提高患者的生存和生活質(zhì)量。

3.3miRNA在食管癌預(yù)后判斷中的作用 在食管癌的治療過程中，預(yù)測食管癌患者的生存時間、疾病進(jìn)展速度以及治療效果對判斷患者預(yù)后十分重要。miRNA在組織和循環(huán)系統(tǒng)中的表達(dá)水平穩(wěn)定可靠，有望成為食管癌患者的有效預(yù)后因子。miR-33a-5p、miR-124-3p作為抑癌基因，在食管癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，其低表達(dá)與患者總體預(yù)后不良相關(guān)，并且與晚期TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[9,22]。Zabihula等[20]研究顯示，miR-490-3p的表達(dá)值與食管癌患者的腫瘤分期和腫瘤大小相關(guān)，Ⅲ期和Ⅳ期患者的miR-490-3p表達(dá)值明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期患者，腫瘤直徑>3 cm患者的miR-490-3p表達(dá)量明顯低于腫瘤直徑<3 cm患者。miR-21亦為致癌基因，Li等[37]發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中miR-21的表達(dá)明顯增加，其表達(dá)與臨床晚期呈正相關(guān)。另有多項研究顯示，miR-30c、miR-516、miR-375、miR-519等也與患者預(yù)后總體生存率相關(guān)[27,29,36,41]。因此，miRNA有助于確定食管癌患者預(yù)后，有望成為判斷食管癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

4 展 望

在食管癌的眾多研究中，對miRNA表達(dá)模式改變的研究可為食管癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)質(zhì)性幫助，通過研究miRNA下游相關(guān)靶點(diǎn)，可進(jìn)一步明確參與食管癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。功能實(shí)驗(yàn)表明，miRNA與癌基因或抑癌基因mRNA相互作用，控制癌細(xì)胞周期、凋亡以及癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。食管癌中miRNA的異常表達(dá)可通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白等影響食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡，同時miRNA也可調(diào)控細(xì)胞鈣黏蛋白表達(dá)影響細(xì)胞侵襲和遷移，許多miRNA可參與增強(qiáng)食管癌細(xì)胞對臨床放療和化療藥物的敏感性，降低耐藥性，有望成為輔助臨床診斷食管癌的潛在生物標(biāo)志物和治療分子靶標(biāo)，具有重要的臨床價值和應(yīng)用前景。

miRNA作為一種新的基因治療方式，具有較好的治療前景，但仍存在一些臨床問題有待進(jìn)一步研究證明，如單個miRNA調(diào)控多個靶基因，一個靶基因被多個miRNA共同調(diào)控。因此，其臨床治療的特異性仍需進(jìn)一步研究，如開發(fā)收集分析患者樣品的合理方案用于食管癌的臨床診斷；合理過表達(dá)或敲低相關(guān)miRNA以增強(qiáng)食管癌患者對放療和化療藥物的敏感性等用于食管癌的臨床治療。因此，食管癌中miRNA作用的分子機(jī)制及臨床應(yīng)用仍需進(jìn)一步研究，以為臨床診斷和治療提供新思路。