鼻咽癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與臨床分期的相關(guān)性研究

黃偉義 梁錦輝 劉家豪 鄧濱 程宇文 黎彩玲 劉園源 羅泳林 李靖 顏建業(yè)

（廣西梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院 廣西梧州 543200）

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，與其他惡性腫瘤相比，鼻咽癌5年總存活率可達(dá)70%～80%[1]。然而晚期鼻咽癌患者5年存活率還有待提高，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是影響晚期鼻咽癌預(yù)后的重要因素[2]。CTCs是指從原發(fā)部位脫落并經(jīng)血液循環(huán)傳播至身體各處的癌細(xì)胞[3]。CTCs進(jìn)入外周血后會(huì)隨血液運(yùn)行黏附及侵襲血管壁，進(jìn)入組織實(shí)質(zhì)并進(jìn)行細(xì)胞分裂增殖，最終實(shí)現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移[4]。最新研究顯示[5-7]，CTCs與肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤病情進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，而關(guān)于CTCs與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系目前研究仍較為有限。因此，本研究將分析CTCs與臨床分期的關(guān)系，旨在為鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，為對(duì)鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早期干預(yù)提供依據(jù)?，F(xiàn)在報(bào)告如下。

1 資料及方法

1.1臨床資料 選取梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院2018年6月至2019年12月收治的100例首診無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織學(xué)確診；患者入組前未接受過手術(shù)或局部放化療治療；預(yù)計(jì)生存期限＞6個(gè)月。另選取100例慢性鼻炎患者為對(duì)照組，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并心肝腎等臟器功能衰竭；患者不愿意配合本次研究。其中男52例，女48例；年齡28～75歲，平均（48.5±4.7）歲；病理類型：低分化型35例，中分化型45例，高分化型20例；T分期：T1 9例，T2 17例，T3 35例，T4 42例；N分期：N0 8例，N1 14例，N2 46例，N3 33例；臨床總分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳa期49例。

1.2方法

1.2.1 CTCs檢測(cè)方法。鼻咽癌及對(duì)照組患者入組后于次日清晨空腹采集第一管外周血行其它項(xiàng)目檢測(cè)，第二管采集5mLEDTA抗凝外周血用于CTCs檢測(cè)，以避免穿刺過程中皮膚上皮細(xì)胞的污染。CTCBIOPSY檢測(cè)系統(tǒng)購自武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司，以微孔濾膜過濾法（ISET）分離外周血CTCs，采用專用的細(xì)胞染色液進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察CTCs形態(tài)學(xué)特征：（1）細(xì)胞體積較大，呈圓形、橢圓形或梭形，長徑多大于10μm；（2）細(xì)胞核異型性，呈折疊、扭曲、結(jié)節(jié)或分葉狀等；核深染且著色不均勻，核膜增厚，出現(xiàn)凹陷或褶皺；核偏位，或巨大核仁；（3）核質(zhì)比異常，多大于0.8。同一個(gè)標(biāo)本中符合上述標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞≥2個(gè)為CTCs陽性。

1.2.2EBERs原位雜交。EBERs原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。將貼有濾膜的載玻片依次放入100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇中脫色；0.4%胃蛋白酶消化10分鐘；EBERs探針雜交過夜；信號(hào)檢測(cè)采用過氧化物酶結(jié)合抗地高辛抗體和3,30-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）；蘇木精復(fù)染。陽性信號(hào)呈棕黃色，局限于細(xì)胞核內(nèi)。

1.2.3 MRI評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。采用MRI評(píng)估患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，取TSE序列，掃描方向?yàn)楣跔蠲?、矢狀面、橫斷面，掃描范圍從鞍上池至胸鎖骨，掃描參數(shù)：層厚/層距為5 mm/1.5 mm，T1W1 TR/TE=400～600/15～25 ms；T2W1：TR/TE=1800～3000/90～150 ms，有以下情況視為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：淋巴結(jié)包膜外侵犯；橫斷面上圖像淋巴結(jié)直徑≥10 mm；同一區(qū)域內(nèi)淋巴結(jié)呈簇狀個(gè)數(shù)≥3個(gè)，且淋巴結(jié)最小直徑≥8 mm；淋巴結(jié)中間出現(xiàn)液化壞死，邊緣環(huán)狀強(qiáng)化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比（%）表示，用百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示計(jì)數(shù)資料，組間比較采用X2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman單因素分析。

2 結(jié)果

2.1鼻咽癌患者與對(duì)照組外周CTCs比較 鼻咽癌患者CTCs陽性表達(dá)率為62%，而對(duì)照組CTCs陽性表達(dá)率為0.0%，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 鼻咽癌患者與對(duì)照組外周血CTCs比較（例，%）

2.2鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率與患者臨床特征的關(guān)系 鼻咽癌患者CTCs在N0～N1分期與N2～N3分期中陽性表達(dá)率存在差異（P＜0.05）。鼻咽癌患者CTCs在T分期中陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。鼻咽癌患者CTCs在臨床總分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳa期中存在差異（P＞0.05）。鼻咽癌患者CTCs在淋巴轉(zhuǎn)移和無淋巴轉(zhuǎn)移中存在差異（P＜0.05）。見表2。

表2 鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率與患者臨床特征的關(guān)系（例，%）

2.3鼻咽癌外周血CTCs與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，鼻咽癌外周血CTCs陽性率與N分期、臨床總分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P＜0.05），而與T分期不相關(guān)（P＞0.05）。見表3。

表3 鼻咽癌外周血CTCs與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

3 討論

隨著鼻咽癌患者病情進(jìn)展，部分癌細(xì)胞可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，由原來病灶播散到淋巴系統(tǒng)、血循環(huán)系統(tǒng)、骨髓系統(tǒng)中，但尚未形成病灶轉(zhuǎn)移，僅發(fā)生腫瘤微轉(zhuǎn)移，當(dāng)微轉(zhuǎn)灶隨血液在靶器官血管壁附著時(shí)即發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大大降低了患者存活率[8-9]。臨床常規(guī)檢查難以發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶微轉(zhuǎn)移，因此容易導(dǎo)致部分腫瘤細(xì)胞脫落原病灶，并在特定條件下被激活而形成轉(zhuǎn)移病灶[10]。腫瘤細(xì)胞從原病灶組織中脫落進(jìn)入血液后，會(huì)受到自身凋亡、血流切變力、體內(nèi)免疫力等作用，會(huì)導(dǎo)致大量癌細(xì)胞侵襲力減弱或凋亡，只有獲得高侵襲性、高成瘤能力的癌細(xì)胞才具備遠(yuǎn)傳轉(zhuǎn)移的可能，這意味著CTCs具備了逃逸免疫監(jiān)測(cè)及干細(xì)胞的生物學(xué)特性。由于鼻咽癌患者的腫瘤細(xì)胞基本都帶有EB病毒基因組，EBERs被認(rèn)為EB病毒潛伏感染的最好標(biāo)志物[11-12]。通過微孔過濾裝置將外周血中的CTCs從血細(xì)胞中分離并富集，后續(xù)應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)EBERs，可以準(zhǔn)確鑒定出真正的鼻咽癌CTCs，確定鼻咽癌CTCs的形態(tài)特征[13]。

目前多項(xiàng)研究表明[14]，外周血CTCs陽性與腫瘤分期有密切的關(guān)系，患者外周血中CTCs數(shù)量越多，患者面臨腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)越大。本研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率為62%，100例慢性鼻炎患者外周血CTCs陽性率為0，表明CTCs是腫瘤患者特有的標(biāo)志物。G Kallergi等[16]應(yīng)用改良免疫磁珠富集聯(lián)合免疫熒光細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)鼻咽癌患者外周CTCs，患者陽性率為82.9%，高于本研究結(jié)果，這可能與CTCs檢測(cè)方法有關(guān)。本研究檢測(cè)方法采用磁珠富集腫瘤細(xì)胞結(jié)合免疫熒光法及熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，不受腫瘤細(xì)胞上皮標(biāo)志物表達(dá)影響，提高了CTCs檢測(cè)準(zhǔn)確性及靈敏性。鼻咽癌N分期是用于評(píng)價(jià)腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，分期越高提示區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)越高，原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管進(jìn)入血液的風(fēng)險(xiǎn)越大。T分期是用于評(píng)價(jià)腫瘤侵犯黏膜層及鄰近結(jié)構(gòu)情況，分期越高提示局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)越高，原發(fā)腫瘤細(xì)胞經(jīng)血管進(jìn)入血液的風(fēng)險(xiǎn)越大。臨床總分期越高提示腫瘤侵襲性越高，患者治療后局部及淋巴結(jié)殘留風(fēng)險(xiǎn)越大，因此增加患者局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。預(yù)后差。本研究經(jīng)Spearman相關(guān)性分析可知，鼻咽癌外周血CTCs陽性率與與N分期、臨床總分期呈正相關(guān)（P＜0.05），表明鼻咽癌患者外周血CTCs與N分期、臨床分期有密切的關(guān)系。提示鼻咽癌患者外周血CTCs陽性者有更高的局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。另本研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者外周血CTCs與T分期無相關(guān)性（r=0.101，P＞0.05），提示鼻咽癌患者外周血CTCs陽性對(duì)局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估價(jià)值較低。

總之，鼻咽癌外周血CTCs與N分期、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系，可作為鼻咽癌局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)，相比較而言，其對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估價(jià)值較高。但腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生理調(diào)控過程，腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血循環(huán)只是病灶轉(zhuǎn)移發(fā)生的一部分，CTCs進(jìn)入血液后需吸附在血管上并侵入靶器官組織，最后完成增殖才形成轉(zhuǎn)移灶。因此對(duì)CTCs進(jìn)行研究時(shí)，除了對(duì)CTCS進(jìn)行定性外，還需要對(duì)CTCs進(jìn)行定量研究，這是由于CTCs數(shù)量越多，最終存活的CTCs數(shù)量越多，最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的幾率越高。而本研究?jī)H對(duì)CTCs進(jìn)行定性分析，缺乏定量分析，因此在日后研究中還需要對(duì)研究進(jìn)一步完善。