靶向抗腫瘤納米粒的制備及其增強(qiáng)聲動(dòng)力/饑餓聯(lián)合治療效果評(píng)估

張 若 張 亮 黃 菊 楊 揚(yáng) 王志剛

聲動(dòng)力治療（sonodynamic therapy，SDT）是通過超聲激活聲敏劑產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧，從而殺傷腫瘤細(xì)胞［1］。與傳統(tǒng)的光動(dòng)力治療（photodynamic therapy，PDT）相比，SDT可以避免能量穿過組織時(shí)發(fā)生的大幅衰減，具有更好的組織穿透性［2］。然而，缺乏腫瘤靶向性的聲敏劑限制了SDT的進(jìn)一步應(yīng)用［3］。IR780是常用的光敏劑，不僅具有良好的PDT效果，還是一種近紅外染料，可用于光聲成像，為腫瘤治療提供直觀的影像學(xué)信息［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)IR780在超聲輻照下可產(chǎn)生大量的活性氧，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡；同時(shí)，IR780可主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，促使納米粒在腫瘤部位的聚集。因此，IR780作為聲敏劑用于SDT得到了廣泛的關(guān)注。但是，單獨(dú)應(yīng)用SDT對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用并不理想，與其他治療方法聯(lián)合使用可以達(dá)到更理想的治療效果［6］。葡萄糖氧化酶（GOx）是人體內(nèi)固有的酶，可通過催化葡萄糖的降解、封鎖細(xì)胞的能量來(lái)源、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的饑餓治療［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)以GOx為核心，嵌有IR780的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）為外殼，擬制備一種核殼結(jié)構(gòu)的多功能納米粒（IG@P納米粒），用以實(shí)現(xiàn)光聲成像、主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞及SDT/饑餓聯(lián)合治療。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

鼠源性乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；PLGA（山東岱罡生物科技有限公司）；IR780、CCK8、GOx、鈣黃綠素（CAM）、碘化吡啶（PI）、聚乙烯醇（PVA）、DiI染料（美國(guó)Sigma公司）；DAPI染料、磷酸鹽緩沖液（PBS）、3，3，5，5，-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）試劑盒（天津博士德生物科技有限公司）；雙骯、胰蛋白酶-EDTA（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；DMEM、10%胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；異丙醇溶液［重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司］。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

超聲波細(xì)胞破碎儀（VC105，美國(guó)Sonics公司）；馬爾文粒徑儀（ZS 90，美國(guó)Malvern公司）；紫外-可見光分光光度計(jì)（UV-23600，日本Shimadzu公司）；多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M3，美國(guó)Bio-Rad公司）；掃描電鏡（Hitachi S-3400N，日本日立公司）；激光共聚焦顯微鏡（Hitachi 7600，日本Nikon公司）；光學(xué)顯微鏡（DP 70，加拿大Olympus公司）；光聲成像儀（Vevo LAZR，加拿大Visual Sonics公司）。

三、主要實(shí)驗(yàn)方法

（一）納米粒的制備

1.IG@P、I@P、G@P、PBS@P納米粒的制備：稱取50 mg PLGA及2 mg IR780溶于3 ml二氯甲烷中；稱取10 mg GOx溶于200μl雙蒸水中。待上述試劑完全溶解后，將200μl含10 mg GOx的雙蒸水加入含PLGA及IR780的二氯甲烷溶液中，并采用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行第1次乳化（90 W，3 min）得到初乳；在初乳中加入10 ml PVA溶液，進(jìn)行第2次乳化（60 W，2 min）得到終乳。將10 ml異丙醇溶液加入終乳中，并進(jìn)行4 h的磁力攪拌，之后，將上述溶液進(jìn)行離心洗滌（8000 r/min，5 min），反復(fù)進(jìn)行3次，從而獲得IG@P納米粒。采用同樣的方法制備不含GOx的納米粒（I@P，200μl雙蒸水替代200μl含有10 mg GOx的雙蒸水）、不含IR780的納米粒（G@P，二氯甲烷溶液中不加IR780），以及僅含有PBS的納米粒（PBS@P，200μl PBS替代200μl含有10 mg GOx的雙蒸水且二氯甲烷溶液中不加IR780）。

2.DiI標(biāo)記的納米粒的制備：在二氯甲烷溶液中加入10μl DiI染料，其余方法同上。

（二）理化性質(zhì)檢測(cè)

1.采用光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡觀察納米粒的形態(tài)。

2.采用馬爾文粒徑儀檢測(cè)IG@P納米粒的粒徑及電位。

3.采用紫外-可見光分光光度計(jì)分析IG@P納米粒及PBS@P納米粒的光學(xué)特性。

4.IG@P納米粒催化活性：參照TMB試劑盒說明書，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)GOx在濃度2.5、5.0、10.0、20.0 mM葡萄糖溶液中的催化活性。

5.超聲作用下檢測(cè)IG@P納米粒產(chǎn)生活性氧能力：將3 ml 50μg/ml IG@P納米粒溶液與單線態(tài)氧熒光探針（50×10-6M）混合，并置于比色皿中，檢測(cè)超聲輻照0、15、30、45、60 s后溶液內(nèi)活性氧產(chǎn)量。

（三）IG@P納米粒光聲成像

將制備好的IG@P納米粒（400μg/ml，200μl）加入凝膠模塊中，采用波長(zhǎng)680～970 nm的激光輻照，采集光聲圖像并分析光聲信號(hào)強(qiáng)度，確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)。將不同濃度（100、200、300、400μg/ml）IG@P納米粒加入凝膠模塊中，用最佳激發(fā)波長(zhǎng)的激光輻照，采集并分析光聲圖像及光聲信號(hào)值。

（四）IG@P納米粒對(duì)4T1細(xì)胞靶向性檢測(cè)

4T1細(xì)胞在DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙抗）中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞采用胰蛋白酶-EDTA從培養(yǎng)瓶中消化下來(lái)，移至共聚焦皿中培養(yǎng)24 h后加入DiI標(biāo)記的IG@P和G@P納米粒（60μg/ml，3 ml），分別孵育1、2、4 h后用多聚甲醛固定，并用DAPI染料進(jìn)行細(xì)胞核染色。最后采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬情況。

（五）IG@P納米粒的細(xì)胞毒性作用

1.CCK8法檢測(cè)納米粒的細(xì)胞毒性：將4T1細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化下來(lái)，并移至96孔板中繼續(xù)孵育24 h。5個(gè)孔為1組，共分5組：對(duì)照組、饑餓治療組（G@P組）、靶向饑餓治療組（IG@P組）、聲動(dòng)力治療組（I@P+US組）、聲動(dòng)力/饑餓聯(lián)合治療組（IG@P+US組）。24 h后對(duì)照組加入200μl PBS，余組加入對(duì)應(yīng)的納米粒（60μg/ml，200μl），并繼續(xù)孵育4 h。I@P+US組、IG@P+US組在孵育4 h后進(jìn)行超聲輻照（2 W/cm2，30 s）并繼續(xù)孵育2 h。最后，每孔加入8μl CCK8染液，采用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處每孔的吸光度（OD值），并計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.CAM/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞毒性：為了更直觀地觀察納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響，將消化下來(lái)的4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)移至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，同樣分為5組：對(duì)照組、G@P組、IG@P組、I@P+US組、IG@P+US組（方法同上），其中I@P+US組、IG@P+US組在孵育4 h后行超聲輻照（2 W/cm2，30 s）并繼續(xù)孵育2 h。最后，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10μl CAM/PI混合染料。30 min后采用PBS沖洗共聚焦培養(yǎng)皿，去除游離的納米粒及染料，加入DAPI染料繼續(xù)孵育15 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞的存活情況。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、IG@P納米粒理化性質(zhì)

1.IG@P納米粒的基本性質(zhì)：IG@P納米粒呈大小均一的球形（圖1A、B），平均粒徑為（248.1±24.3）nm（圖1C），平均電位為（-14.7±2.38）mV。紫外吸收光譜可見IG@P納米粒在783 nm處有明顯的吸收峰，而PBS@P納米粒無(wú)明顯吸收峰（圖1D）。

2.IG@P納米粒的催化活性：波長(zhǎng)650 nm處可檢測(cè)到GOx催化葡萄糖分解產(chǎn)生的過氧化氫與TMB反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)；隨著葡萄糖濃度的增加，IG@P納米粒的催化速度增加。見圖1E。

3.IG@P納米粒的活性氧產(chǎn)量：在超聲輻照下IG@P納米?？僧a(chǎn)生大量的活性氧，且隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，活性氧的產(chǎn)量逐漸增加。見圖1F。

二、IG@P納米粒體外光聲成像

IG@P納米粒在783 nm處有明顯吸收峰，見圖2A。在783 nm的激光輻照下，隨著IG@P納米粒濃度的增加（100、200、300、400μg/ml），光聲信號(hào)強(qiáng)度呈線性增強(qiáng)。見圖2B、C。

三、IG@P納米粒對(duì)4T1細(xì)胞靶向性

DiI標(biāo)記的IG@P及G@P納米粒均呈紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。激光共聚焦顯微鏡下觀示，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，DiI標(biāo)記的IG@P納米粒在細(xì)胞內(nèi)的聚集逐漸增多（圖3A）；而DiI標(biāo)記的G@P納米粒在細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯聚集（圖3B）。

四、IG@P納米粒的細(xì)胞毒性作用

1.CCK8法檢測(cè)納米粒的細(xì)胞毒性：對(duì)照組、G@P組、IG@P組、I@P+US組腫瘤細(xì)胞存活率分別為100%、（65.78±8.3）%、（47.4±9.9）%、（41.9±10.9）%，IG@P+US組腫瘤細(xì)胞存活率最低，僅（17.5±9.2）%，與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；IG@P組與G@P組、I@P+US組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 IG@P納米粒的理化性質(zhì)

圖2 IG@P納米粒體外光聲成像檢測(cè)

2.CAM/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞毒性：納米粒濃度為60μg/ml時(shí)，IG@P+US組細(xì)胞幾乎全部死亡（大片紅色熒光），而對(duì)照組細(xì)胞活性幾乎不受影響（大片綠色熒光）。見圖4。

討 論

圖3 孵育1、2、4 h后4T1細(xì)胞對(duì)DiI標(biāo)記的IG@P納米粒（A）及G@P納米粒（B）吞噬情況的激光共聚焦顯微鏡下觀（×200）

SDT是一種新興的腫瘤治療方式，由超聲波激發(fā)聲敏劑后引發(fā)聲化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧，從而引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。聲敏劑在無(wú)超聲輻照時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，僅在超聲輻照下才在輻照區(qū)域產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧，對(duì)周邊正常組織損傷小，安全性高［3］。相較于傳統(tǒng)的放化療，SDT具有良好的時(shí)間及空間選擇性、無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)勢(shì)［1］。SDT主要包括兩個(gè)步驟，先是將聲敏劑遞送至腫瘤部位，隨后給予超聲輻照激發(fā)聲敏劑，產(chǎn)生聲動(dòng)力效果［8］。但聲敏劑靶向性差，在腫瘤部位的富集效果差，限制了SDT的進(jìn)一步應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IR780作為聲敏劑，可在超聲輻照的激發(fā)下產(chǎn)生大量的活性氧，隨著超聲輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，活性氧的產(chǎn)量增多。過量的活性氧增加了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激壓力，引起細(xì)胞的氧化損傷，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。且IR780是脂溶性熒光小分子，可在不借助任何化學(xué)修飾的情況下靶向腫瘤細(xì)胞，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)其的吞噬［4-5］。IR780靶向機(jī)制可能由于IR780為親脂性陽(yáng)離子，通過靜電吸附作用與帶負(fù)電的腫瘤細(xì)胞膜相互作用，從而增加了納米粒在腫瘤內(nèi)部的聚集［9］。本實(shí)驗(yàn)4T1細(xì)胞靶向?qū)嶒?yàn)表明，與未裝載IR780的納米粒（G@P納米粒）比較，IG@P納米?？蓪?shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的富集，證實(shí)IR780賦予了納米粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。IR780的主動(dòng)靶向性通過增加載有聲敏劑的納米粒在細(xì)胞內(nèi)的聚集，增加了超聲輻照下活性氧的產(chǎn)量，從而有望增效聲動(dòng)力作用，進(jìn)而增加對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

圖4 CAM/PI雙染法檢測(cè)各組4T1細(xì)胞毒性的激光共聚焦顯微鏡下觀（×200）

研究［10］表明，聯(lián)合治療較單一治療效果更顯著。臨床上常用的輔助治療手段為化療，但是化療具有嚴(yán)重的副作用，限制其的進(jìn)一步應(yīng)用。大部分腫瘤細(xì)胞以葡萄糖為主要能量來(lái)源，用以維持其生長(zhǎng)及增殖。GOx作為一種天然酶，可催化葡萄糖分解，具有良好的生物安全性，被用于腫瘤的饑餓治療。但GOx是非特異性催化葡萄糖分解，易導(dǎo)致正常組織內(nèi)葡萄糖含量下降而損傷健康組織。本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞靶向?qū)嶒?yàn)表明IR780的主動(dòng)靶向作用，可促進(jìn)納米粒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性聚集，因此，GOx可以特異性地消耗腫瘤細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖，切斷腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)增殖而不損傷周圍正常細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)使用PLGA為載體包載IR780及GOx用于乳腺癌的聯(lián)合治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包載于納米粒內(nèi)的IR780及GOx體外聲動(dòng)力及催化效果未受到影響；隨后的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，靶向組（IG@P組）細(xì)胞存活率明顯低于非靶向組（G@P組），且聲動(dòng)力治療與饑餓治療聯(lián)合應(yīng)用（IG@P+US組）較單一治療（G@P組、I@P+US組）低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明SDT與饑餓治療聯(lián)合應(yīng)用具有更顯著的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，IR780介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞靶向作用可增效抗腫瘤治療效果。

隨著納米醫(yī)療的不斷發(fā)展，診療一體化的納米探針受到越來(lái)越多的關(guān)注。光聲成像是近年來(lái)新興的診斷方法，可實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療過程。其成像原理是在激光的激發(fā)下，分子將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熱能，隨后引起組織的形態(tài)改變從而被超聲波探測(cè)，形成光聲圖像。光聲成像彌補(bǔ)了傳統(tǒng)光學(xué)成像組織穿透性差及超聲成像組織分辨率低的不足，將兩者優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，通過不同波長(zhǎng)的光激發(fā)，實(shí)現(xiàn)對(duì)深部組織的高分辨成像［11］。本實(shí)驗(yàn)中，IG@P納米粒在783 nm處光聲信號(hào)最明顯，且光聲信號(hào)隨著納米粒的濃度呈線性增強(qiáng)，表明IR780作為近紅外染料，具有良好的光聲成像效果，可以用于監(jiān)測(cè)抗腫瘤治療效果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功制備了具有腫瘤靶向作用的IG@P多功能納米粒，可用于光聲成像，且可增效SDT/饑餓聯(lián)合治療，為腫瘤的治療提供了新的思路。但本實(shí)驗(yàn)未能進(jìn)一步在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證，且IR780靶向腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制尚不完全明確，均有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步完善。