海芒果果實水提物及其原兒茶酸對米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ的影響

孫 東，陳 琪，朱 博，段美娜

（1.廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088；2.暨南大學生命科學技術(shù)學院，廣東 廣州 510632；3.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010）

有害藻華（harmful algal blooms,HABs）頻發(fā)于世界各地沿海，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、旅游業(yè)等造成嚴重的經(jīng)濟損失，甚至威脅到海洋生態(tài)安全和人類健康，已經(jīng)成為國際社會共同關注的重大海洋環(huán)境問題和生態(tài)災害[1-2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，HABs 在全球范圍內(nèi)每年可造成約80 億美元的經(jīng)濟損失[3]。米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）是一種典型的有害甲藻，是一種常見的魚毒性赤潮藻，屬于甲藻門，裸甲藻目，凱倫藻屬，分布廣泛，常在太平洋沿岸[4]、印度洋和中國東南海暴發(fā)形成HABs[5]。我國東海從2002 年開始，幾乎每年暴發(fā)米氏凱倫藻藻華，造成魚類、貝類和其他海洋無脊椎動物的大量死亡[6]，已經(jīng)嚴重威脅到近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)的安全。

應對HABs 的措施大致分為兩類，即預防HABs 發(fā)生和在HABs 發(fā)生時進行控制。大量用于防治和控制赤潮發(fā)生的研究集中在物理、化學和生物學方法[7]。其中，海洋植物（藻類等）、沉水植物和紅樹植物的代謝產(chǎn)物（化感物質(zhì)）等生物學方法具有污染程度小、容易降解、對近海海洋生態(tài)系統(tǒng)微生物群落干擾較小[7]等特點，為防治和控制HABs的發(fā)生提供新的方向[8]。

原兒茶酸（protocatechuic acid，PA）存在于多種紅樹植物中，海芒果（Cerbera manghas）中含有大量的PA[9-10]。PA 具有抗癌、抗衰老、抗病毒、抗菌，以及保護肝臟、腎臟的功能[11]，與其他酚酸類物質(zhì)可以通過植被腐爛、植物根系分泌等方式釋放到海洋壞境中[12]。葉綠體是決定藻類光合能力的關鍵，其對環(huán)境脅迫最為敏感[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，化感物質(zhì)可以促進自由基和活性氧（reactive oxygen species,ROS）的生成，進而對藻細胞的細胞器產(chǎn)生損傷。當持續(xù)暴露或者化感物質(zhì)濃度較高時，細胞無法清除自由基和活性氧，因此，藻細胞表現(xiàn)出氧化損壞或死亡的情況[14-15]。同時，多環(huán)芳烴和重金屬等污染物可破壞植物葉綠體，降低光合效率[16-17]，而光合能力的強烈抑制勢必會延緩藻類的生長和發(fā)育，達到抑制藻類生長的目的，進而控制赤潮發(fā)生。

為了探討紅樹植物及其主要抑藻物質(zhì)對赤潮藻的抑制效應，以及對赤潮藻的光合系統(tǒng)PSⅡ的抑制機制，本研究開展了紅樹植物果實水提液及其主要抑藻物質(zhì)對米氏凱倫藻生長、光合系統(tǒng)PSⅡ的抑制作用及機制研究，探尋不同濃度水提物和抑藻物質(zhì)對赤潮藻光合作用的生理學差異，闡明紅樹植物及其主要抑藻物質(zhì)對赤潮藻的生理學機制，以期為防治赤潮發(fā)生提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 赤潮藻的實驗室培養(yǎng)

實驗藻種米氏凱倫藻（Karenia mikimotoiGY-H36）購置于上海光語生物科技有限公司，保種于暨南大學生命科學技術(shù)學院。

藻種培養(yǎng)：接種于f/2 滅菌培養(yǎng)基中（表1），培養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱（新苗GZX-300BSH-Ⅲ，上海），其中海水配制采用人工海鹽（Dragon King，廣州）配制鹽度為 29±1。照度設置為 100 μmol·m-2·s-1，光暗周期比12 h∶12 h，溫度為（20±1）℃，每天輕輕搖晃并交換位置3 次。

1.2 海芒果果實水提物的制備

海芒果（C.manghas）果實采集于珠海市淇澳島紅樹林自然保護區(qū)。新鮮果實收集后，用蒸餾水洗凈，擦拭干凈，去果核，再經(jīng)-80 ℃冷凍干燥（Wizard 2.0，Virtis，美國），用打粉機將凍干后的果實打成干粉備用。

稱量100 g 海芒果干粉加入到2 L 已滅菌的f/2培養(yǎng)基中。混合物封口后經(jīng)70 ℃水浴加熱24 h，再超聲處理2 h，得到渾濁的褐色水提物。把該水提物經(jīng)過濾紙過濾除渣，再經(jīng)過孔徑0.22 μm 濾膜過濾以去除微生物，4 ℃下避光保存。母液濃度為50 g·L-1。

1.3 海芒果提取物抑藻率的計算

將海芒果果實水提物母液（50 g·L-1）按梯度稀釋至0.312 5、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1，總體系為50 mL（表2）。米氏凱倫藻接種濃度為4.5×104L-1，每組設置3 個平行。每日取樣1 mL 用體積分數(shù)4%的甲醛固定進行細胞計數(shù)。計算抑制率IR，公式如下：

表2 海芒果提取物抑藻率實驗設計Table 2 Experimental design of algae inhibition

1.4 原兒茶酸母液的制備

購買原兒茶酸（TargetMol，美國，99.9%，CAS:99-50-3）標準品用于后續(xù)實驗。配置10 g·L-1的母液，按梯度稀釋至25、50、75、100、125 mg·L-1，總反應體積為50 mL。抑制率計算方法同1.3 節(jié)。

1.5 葉綠素快速熒光參數(shù)的測定

取2 mL 藻液于植物效率儀反應杯中，室溫下遮光暗適應20 min。采用手持式植物葉綠素快速熒光儀（Handy Plant Efficiency Analyzer,Handy PEA,Hansatech,英國）檢測葉綠素熒光動力學參數(shù)。

Handy PEA 使用過程：設置參數(shù) 3 000 μmol·m-2·s-1，增益為1.0×。用f/2 培養(yǎng)基將儀器調(diào)零后，將反應杯放入液體檢測器中，測定葉綠素熒光誘導動力學（OJIP）指標。通過分析得到OJIP曲線及相關光合系統(tǒng)Ⅱ電子傳遞相關參數(shù)。JIP-test相關參數(shù)和計算公式[19-20]見表3。

表3 JIP-test 相關參數(shù)和計算公式Table 3 Parameters and formulas of JIP-test

1.6 統(tǒng)計分析

所有實驗結(jié)果為3 組平行實驗分析所得，并采用平均值±SD 表示。組間差異顯著性分析采用One-way ANOVA 和LSD（SPSS statistics 25，IBM）進行統(tǒng)計分析，P＜ 0.05 為差異顯著。使用origin 8.5進行分析制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海芒果果實水提物及其抑藻物質(zhì)對米氏凱倫藻生長的影響

海芒果果實水提物可顯著抑制米氏凱倫藻的生長（圖1_A），且呈現(xiàn)出“低濃度促進、高濃度抑制”現(xiàn)象以及典型的“劑量-效應”關系，即低質(zhì)量濃度（0.625 g·L-1）時促進藻類生長，當質(zhì)量濃度逐漸升高時，抑制率顯著增加。圖1_B 顯示，在海芒果果實水提物質(zhì)量濃度為5 g·L-1，暴露120 h時，對米氏凱倫藻的抑制率為（99.87±0.04）%，已經(jīng)達到完全抑制的效果。原兒茶酸對米氏凱倫藻也有顯著的抑制效應（圖1_C），在暴露120 h 時，質(zhì)量濃度為25、50 mg·L-1的原兒茶酸對米氏凱倫藻出現(xiàn)了顯著的抑制作用，但原兒茶酸質(zhì)量濃度為25 mg·L-1時抑制率較低，為（17.82±2.58）%（圖1_D）。隨著質(zhì)量濃度的升高，其抑制率逐漸增加，至75 mg·L-1時，已經(jīng)出現(xiàn)了完全抑制效應。

圖1 海芒果果實水提物及其只要抑藻物質(zhì)原兒茶酸對米氏凱倫藻的生長影響及120 h 抑制率Fig.1 Growth and 120 h inhibitory effects of fruit water extract and PA of Cerbera manghas L.on Karenia mikimotoi

2.2 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻光合作用的影響

圖2 描述了海芒果果實水提物對米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ相對熒光值的影響。隨暴露時間的延長，米氏凱倫藻相對熒光值逐漸增加。在暴露48、72 h時，0.625、1.25 g·L-1的海芒果果實水提物對米氏凱倫藻的影響出現(xiàn)典型的“低濃度促進、高濃度抑制”的現(xiàn)象。10 g·L-1的海芒果果實水提物出現(xiàn)了最高抑制光合系統(tǒng)Ⅱ相對熒光產(chǎn)量的情況，在48 h時，其J-I-P相迅速下降；在120 h 時，熒光產(chǎn)量幾乎完全消失。

圖2 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動力學曲線的影響Fig.2 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to fruit water extract for Cerbera manghas

為進一步了解海芒果果實水提液對米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ的影響，通過公式計算得到JIP-test相關數(shù)據(jù)進行分析，并得到以下結(jié)果（圖3）。反應中心密度指標RC/CS0在高質(zhì)量濃度組（5、10 g·L-1）均顯著低于對照組，且隨質(zhì)量濃度上升而下降。單位激發(fā)界面能量通量相關指標（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在高質(zhì)量濃度組，120 h 時均出現(xiàn)了不同程度的下降，且隨著質(zhì)量濃度的上升而下降。與QA還原光合系統(tǒng)Ⅱ反應中心能量通量的數(shù)據(jù)顯示，120 h 時，TR0/RC 無顯著差異，高質(zhì)量濃度處理組（5、10 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著低于對照組。熒光產(chǎn)量和通量比相關指標φP0、φE0和0ψ中，中高質(zhì)量濃度組（2.5、5 g·L-1）φE0和0ψ出現(xiàn)上升的趨勢，而10 g·L-1的處理組則顯示出下降的現(xiàn)象；φP0則表現(xiàn)出隨著質(zhì)量濃度增加，值也相對增加的情況。

圖3 海芒果果實水提物對米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時-JIP 參數(shù)的影響Fig.3 Effect of fruit water extract for Cerbera manghas on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

2.3 原兒茶酸對米氏凱倫藻光合作用的影響

海芒果果實水提物中抑藻物質(zhì)含量較多的原兒茶酸對米氏凱倫藻光合系統(tǒng)Ⅱ相對熒光值的影響（圖4）。隨著暴露時間延長，米氏凱倫藻的相對熒光值逐漸增加。原兒茶酸抑藻過程中并未出現(xiàn)海芒果果實水提物“低促高抑”現(xiàn)象。在24 h 時，125 g·L-1處理組中J-I-P 相迅速下降，且隨著時間延長而逐漸降低。其他各組均隨著質(zhì)量濃度的升高，其相對熒光值出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢。120 h 時，50 g·L-1的原兒茶酸就已經(jīng)對米氏凱倫藻出現(xiàn)顯著的抑制情況。

圖4 原兒茶酸對米氏凱倫藻葉綠素快速熒光動力學曲線的影響Fig.4 Rapid increase in fluorescence transients for Karenia mikimotoi exposed to Protocatechuic acid

反應中心密度指標RC/CS0在中高質(zhì)量濃度組（25～ 125 g·L-1）均顯著低于對照組（圖5_E），且隨質(zhì)量濃度上升而下降，同時，25 g·L-1的RC/CS0略高于對照組。單位激發(fā)界面能量通量相關指標（ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0）在中高質(zhì)量濃度組（25～ 125 g·L-1），24～ 120 h 時，均出現(xiàn)隨質(zhì)量濃度的上升而下降現(xiàn)象（圖5_B-E）。與QA還原光合系統(tǒng)Ⅱ反應中心能量通量的數(shù)據(jù)顯示，120 h 時，高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）TR0/RC 出現(xiàn)增加現(xiàn)象，其他各處理組均無顯著變化。高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）的DI0/RC 和ABS/RC 均顯著高于對照組，其他組與對照組均無顯著變化。熒光產(chǎn)量和通量比指標中，φP0無顯著變化。中質(zhì)量濃度組（50、75 g·L-1）φE0和0ψ出現(xiàn)上升趨勢，高質(zhì)量濃度組（125 g·L-1）則顯示下降現(xiàn)象。

圖5 原兒茶酸對米氏凱倫藻葉綠素a 熒光瞬時-JIP 參數(shù)的影響Fig.5 Effect of Protocatechuic acid on chlorophyll a fluorescence transient-JIP parameters in Karenia mikimotoi

3 討論

本研究結(jié)果表明，海芒果果實提取物及其主要化感物質(zhì)可顯著抑制常見赤潮藻米氏凱倫藻的生長，且能干擾米氏凱倫藻光合效能。相關研究也證實許多植物的組織、提取物、分泌物和代謝產(chǎn)物等可抑制藻類生長[21-23]。海芒果為一種半紅樹植物，我國東南沿海、南海北部沿岸均廣泛分布，其生態(tài)位與赤潮藻暴發(fā)時期的生態(tài)位部分重疊。因此，海芒果在赤潮防治中有獨特的研究空間和研究價值。

化感物質(zhì)會影響藻類光合系統(tǒng)，甚至會影響到ATP 的合成[24]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的逐漸升高，米氏凱倫藻的熒光動力學曲線J-I-P 相明顯下降，說明海芒果果實水提物和PA 均會抑制米氏凱倫藻的光系統(tǒng)PSⅡ的光活化。有研究發(fā)現(xiàn)，I-P 相降低是因為QB非還原中心比例增加導致的QA到QB的電子轉(zhuǎn)移受阻而引起的[25]。且隨著濃度的增加，F(xiàn)0、Fi、Fj和Fm均出現(xiàn)逐漸降低的情況，說明PSⅡ供體側(cè)的電子轉(zhuǎn)移受阻逐漸嚴重[26]。F0的逐漸降低可能是藻密度降低所引起的，然而O-I-J 相的降低可能是因為PSⅡ中天線復合體結(jié)構(gòu)受損，同時抑制了PSⅠ的活性，進而導致電子轉(zhuǎn)移受阻[27-28]。這與本課題之前的研究結(jié)果相類似[19]，也與其他重金屬、多環(huán)芳烴、高溫等脅迫的研究結(jié)果相似[29-30]。因此，可推斷海芒果果實水提物和PA 與可能導致米氏凱倫藻光系統(tǒng)PSⅡ的供體和受體側(cè)結(jié)構(gòu)和功能受損，天線復合體電子傳遞受阻有關。

中高質(zhì)量濃度組ABS/CS0、DI0/CS0、ET0/CS0、TR0/CS0等參數(shù)的降低，表明水提液和PA 能夠抑制米氏凱倫藻光合系統(tǒng)對電子的吸收、電子傳遞；而DI0/RC 和ABS/RC 的增加，則表明了耗散和每反應中心吸收值的增加。筆者此前的研究發(fā)現(xiàn)，在96 h時，稀土元素鑭對微藻的DI0/RC 和ABS/RC 并無顯著變化[19]。有研究顯示，ABS/RC 的增加表明了反應中心失活，或者反應中心PSⅡ受到抑制或損傷[30]，而ABS/RC 的增加往往會導致DI0/RC 的增加，而DI0/RC 的增加進一步導致ROS 的產(chǎn)生，引起光合器的過氧化損傷[31]。因此，可推測高質(zhì)量濃度組的DI0/RC 增加加速了ROS 的產(chǎn)生，引起了光合器的過氧化損傷加重；而中低質(zhì)量濃度組DI0/RC 降低可以有效緩解脅迫帶來的過氧化損傷，這可能是米氏凱倫藻受脅迫后的一種自我調(diào)控保護機制。此外，PA 處理組中光合性能指數(shù)（Performance Index，PI）φE0和0ψ下降可能由光合系統(tǒng)中能量吸收、捕獲和電子轉(zhuǎn)移受阻引起[32]。

4 結(jié)論

本研究證明海芒果果實水提物及其主要物質(zhì)原兒茶酸可以有效抑制米氏凱倫藻的生長。米氏凱倫藻受到脅迫后，其光合系統(tǒng)Ⅱ的反應中心密度、單位激發(fā)界面能量通量和QA還原光合系統(tǒng)反應中心均發(fā)生了變化，最終導致光合系統(tǒng)電子傳遞和電子吸收障礙，進而導致米氏凱倫藻生長受到抑制。這些結(jié)果表明海芒果及原兒茶酸可以作為一種有效防治赤潮發(fā)生的天然抑藻物質(zhì)，以期為我國近海岸赤潮防治提供基礎數(shù)據(jù)。