不同產(chǎn)地羅布麻葉UPLC特征圖譜及黃酮類成分含量測(cè)定△

吳淑珍，何民友，李國(guó)衛(wèi)，吳文平，邱韻靜，曾薈，潘禮業(yè)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

羅布麻葉為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉，為夏季采收，除去雜質(zhì)，干燥。其具有平肝安神、清熱利水的功效，可用于治療肝陽(yáng)眩暈、心悸失眠、浮腫尿少[1]。羅布麻葉中主要含黃酮類、酸類、脂肪酸醇酯類、醇類、鞣質(zhì)類、甾體類、糖類、氨基酸類、揮發(fā)油、礦物質(zhì)元素等化學(xué)成分[2-13]。其中，黃酮類為羅布麻葉的主要活性成分，具有抗抑郁、抗氧化、降血壓、調(diào)血脂、保肝等功效，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[14-15]。羅布麻是一種抗逆性極強(qiáng)的宿根性多年生直立半灌木，多野生在鹽堿荒地、灘涂濕地及河流湖泊沿岸、戈壁荒灘等鹽堿度較高的土壤中，在我國(guó)主要分布于河南、安徽、湖南、四川、甘肅、江蘇、陜西、山西、河北等地[16]。張?jiān)聥鹊萚17]采用高效液相色譜法(HPLC)建立特征圖譜，并分析了不同產(chǎn)地羅布麻葉中槲皮素的含量。結(jié)果表明，不同來(lái)源羅布麻葉HPLC特征圖譜及槲皮素的含量均具有一定差異。宋建平等[18]和王媚等[19]分別采用HPLC、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)建立了羅布麻葉的特征圖譜分析方法，同時(shí)評(píng)價(jià)了不同產(chǎn)地羅布麻葉藥材的質(zhì)量。

目前，雖有文獻(xiàn)研究羅布麻葉藥材特征圖譜或指紋圖譜，但僅以相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，未對(duì)其色譜峰進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版羅布麻葉項(xiàng)下以金絲桃苷作為指標(biāo)成分，難以全面反映其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜法(UPLC)建立羅布麻葉藥材特征圖譜，結(jié)合相似度、主成分分析及聚類判別模式對(duì)不同產(chǎn)地的羅布麻葉藥材進(jìn)行質(zhì)量分析，并對(duì)2個(gè)黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定，為羅布麻葉藥材質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class型超高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世有限公司)；Vanquish型超高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；Waters CORTECS T3型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；ME204E型萬(wàn)分之一天平、XP26型百萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品金絲桃苷(批號(hào)：111521-201809，純度：94.9%)、異槲皮苷(批號(hào)：111809-201804，純度：97.2%)、綠原酸(批號(hào)：110753-201817，純度：96.8%)、槲皮素(批號(hào)：200081-201509，純度：98.6%)、山柰酚(批號(hào)：110860-201611，純度：95.5%)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品新綠原酸(批號(hào)：wkq18030107，純度≥98%)、隱綠原酸(批號(hào)：wkq16081903，純度≥98%)均購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；乙醇、甲醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；液相用磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈、甲醇(默克股份有限公司，色譜級(jí))；水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

羅布麻葉來(lái)源于全國(guó)7個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司潘禮業(yè)主管中藥師鑒定為夾竹桃科植物羅布麻ApocynumvenetumL.的干燥葉，具體產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 16批羅布麻葉藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters CORTECS T3型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～7 min，6%～12%A；7～11 min，12%～13%A；11～17 min，13%～15%A；17～20 min，15%～19%A；20～25 min，19%～30%A；25～28 min，30%～60%A；28～33 min，60%～75%A)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)三號(hào)篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流90 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品金絲桃苷2.122 mg、異槲皮苷2.209 mg、綠原酸2.064 mg、山柰酚2.056 mg，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為100.688 9、107.357 4、99.897 6、98.174 0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液；精密稱取對(duì)照品新綠原酸2.346 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為45.981 6 μg·mL-1的對(duì)照品溶液；精密稱取對(duì)照品隱綠原酸2.036 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為79.811 2 μg·mL-1的對(duì)照品溶液；精密稱取對(duì)照品槲皮素2.145 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為211.497 0 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4 特征圖譜的建立及評(píng)價(jià)

2.4.1精密度試驗(yàn) 取S3藥材粉末，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄色譜圖，以金絲桃苷峰為參照，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其中相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.18%，相對(duì)峰面積RSD為0.80%～1.36%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S3藥材粉末，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以金絲桃苷峰為參照，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其中相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.01%～0.34%，相對(duì)峰面積RSD為0.08%～2.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取S3藥材粉末6份，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以金絲桃苷峰為參照，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其中相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.17%，相對(duì)峰面積RSD為0.19%～2.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4特征圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.4.4.1特征圖譜的建立 取16批羅布麻葉藥材，按照2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。將16批藥材特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件中，選擇S1羅布麻葉的色譜圖為參照?qǐng)D譜，以“平均數(shù)”法作為對(duì)照?qǐng)D譜生成方式，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，多點(diǎn)校正后，在全譜峰匹配模式下生成16個(gè)共有峰，并生成對(duì)照?qǐng)D譜R，見(jiàn)圖1～2。

圖1 16批羅布麻葉藥材UPLC特征圖譜

注：1.新綠原酸；2.綠原酸；3.隱綠原酸；7(S).金絲桃苷；8.異槲皮苷；15.槲皮素；16.山柰酚；圖3同。圖2 羅布麻葉藥材UPLC對(duì)照?qǐng)D譜

根據(jù)對(duì)照品指認(rèn)，確定了羅布麻葉特征圖譜中峰1為新綠原酸、峰2為綠原酸、峰3為隱綠原酸、峰7為金絲桃苷、峰8為異槲皮苷、峰15為槲皮素、峰16為山柰酚，見(jiàn)圖3。

注：A.羅布麻葉供試品(批號(hào)：S3)；B～H.對(duì)照品。圖3 羅布麻葉供試品與對(duì)照品色譜圖

2.4.4.2相似度評(píng)價(jià) 在“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)中，系統(tǒng)根據(jù)各批次樣品色譜圖的共有模式生成對(duì)照?qǐng)D譜R，計(jì)算出S1～S16羅布麻葉藥材特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜R的相似度分別為0.992、0.999、0.994、0.997、0.999、0.994、0.996、0.998、0.987、0.999、0.996、0.995、0.994、0.986、0.991、0.998，各批次藥材與對(duì)照?qǐng)D譜之間的相似度均大于0.95，說(shuō)明各批次藥材的相似度良好。

2.4.4.3聚類分析 運(yùn)用SPSS 20.0軟件，以單位質(zhì)量藥材的16個(gè)共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法，以余弦作為樣品相似度的距離公式，對(duì)16批藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由結(jié)果可知，當(dāng)16批樣品分為4類時(shí)，Ⅰ類包括S4、S5、S10、S12、S16，即安徽省阜陽(yáng)市的2批樣品、湖南省邵陽(yáng)市的1批樣品和河南省駐馬店市的2批樣品聚為一類；Ⅱ類包括S9、S11、S15，即湖南省邵陽(yáng)市1批樣品、河南省南陽(yáng)市1批樣品、河南省駐馬店市1批樣品聚為一類；Ⅲ類包括S2、S3、S8，即四川省成都市2批樣品、湖南省邵陽(yáng)市1批樣品聚為一類；Ⅳ類包括S1、S6、S7、S13、S14，即四川省成都市1批樣品、安徽省阜陽(yáng)市2批樣品、河南省駐馬店市2批樣品聚為一類。各產(chǎn)地羅布麻葉藥材離散于4類中，分布不集中，因此，需對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖4 16批羅布麻葉樣品聚類分析結(jié)果

2.4.4.4主成分分析 將16批羅布麻葉藥材UPLC圖譜中的共有峰峰面積除以藥材的取樣量，得到單位質(zhì)量藥材的峰面積；再借助SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差，見(jiàn)表2，載荷圖見(jiàn)圖5。按照主成分對(duì)應(yīng)的特征值>1的提取原則，提取了4個(gè)主成分，其中主成分1的特征值為6.919，方差貢獻(xiàn)率為43.246%；主成分2的特征值為3.518，方差貢獻(xiàn)率為21.990%；主成分3的特征值為2.030，方差貢獻(xiàn)率為12.685%；主成分4的特征值為1.637，方差貢獻(xiàn)率為10.232%。前4個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率為88.154%，說(shuō)明該4個(gè)主成分可代表羅布麻葉特征圖譜共有峰的大部分信息。

表2 16批羅布麻葉樣品主成分特征值及方差

圖5 16批羅布麻葉樣品主成分分析荷載圖

由主要因子載荷矩陣(表3)可知，16個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)了影響主成分的16個(gè)變量，特征向量的數(shù)值及符號(hào)代表變量在主成分中的權(quán)重，權(quán)重越大，表明該化合物在藥材主成分分析中作用越大。第一主成分主要反映了來(lái)自色譜峰1、6、11的信息，第二主成分主要反映了來(lái)自色譜峰7、8、15的信息，第三主成分主要反映了來(lái)自色譜峰4、9、12的信息，第四主成分主要反映了來(lái)自色譜峰10、13、14的信息，故僅用前4個(gè)主成分就可表示羅布麻葉藥材UPLC數(shù)據(jù)的主要信息，是16批羅布麻葉藥材差異性的主要影響因素。

表3 16批羅布麻葉樣品主成分分析主要因子荷載矩陣

2.4.4.5不同產(chǎn)地羅布麻葉藥材的綜合評(píng)價(jià) 針對(duì)前4個(gè)主成分對(duì)羅布麻葉藥材進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，計(jì)算綜合得分，見(jiàn)表4。由結(jié)果可知，排名前9的樣品中，河南省駐馬店市4批、四川省成都市2批、安徽省阜陽(yáng)市2批、湖南省邵陽(yáng)市1批?？傮w來(lái)說(shuō)，河南省駐馬店市產(chǎn)的羅布麻葉整體上質(zhì)量較優(yōu)，但藥材質(zhì)量并不均勻，綜合排名分布較分散；四川、安徽、湖南產(chǎn)的羅布麻葉綜合排名分布較分散。

表4 不同產(chǎn)地羅布麻葉綜合得分

2.5 含量測(cè)定

2.5.1線性關(guān)系考察 精密稱定對(duì)照品金絲桃苷6.325 mg和異槲皮苷8.153 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得金絲桃苷和異槲皮素混合對(duì)照品母液。分別精密吸取混合對(duì)照品母液0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，連同金絲桃苷和異槲皮苷混合對(duì)照品母液分別按照2.1項(xiàng)下色譜條件依次測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)建立線性回歸方程。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7 411 511.0X+1 755.0，r=0.999 7，在15.038～601.508 μg·mL-1金絲桃苷質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好；異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=7 514 521.6X+3 520.8，r=0.999 7，在18.935～757.414 μg·mL-1異槲皮苷質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.2精密度試驗(yàn) 取S3藥材粉末，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD分別為2.08%、2.09%，表明儀器精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S3藥材粉末，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定，金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD分別為1.57%、1.55%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn) 取S3藥材粉末共6份，精密稱定，按2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄金絲桃苷和異槲皮苷的峰面積，分別計(jì)算藥材中金絲桃苷和異槲皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，金絲桃苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.370%(RSD=0.86%)，異槲皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.396%(RSD=0.72%)，表明重復(fù)性符合要求。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定對(duì)照品金絲桃苷9.036 mg和異槲皮苷8.847 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品母液。取50 mL錐形瓶，平行3組，每組3份，分別加入母液0.5、1.0、1.5 mL，用氮吹儀吹干后加入羅布麻葉藥材0.25 g，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄金絲桃苷和異槲皮苷的峰面積，計(jì)算金絲桃苷和異槲皮苷加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表5 羅布麻葉中金絲桃苷和異槲皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6樣品測(cè)定 取16批羅布麻葉藥材，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。S1～S16中的金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于0.30%，即16批藥材都符合《中國(guó)藥典》2020年版含量限度的要求。16批羅布麻葉藥材金絲桃苷、異槲皮苷及總質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定的波動(dòng)，但波動(dòng)不大，說(shuō)明不同產(chǎn)地的羅布麻葉藥材金絲桃苷和異槲皮苷含量相對(duì)較穩(wěn)定，差異較小。從各產(chǎn)地總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值來(lái)看，以安徽省阜陽(yáng)市產(chǎn)的羅布麻葉總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值最高，為0.97%；其次是河南省駐馬店市，為0.94%，兩地總質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異不大。

表6 16批羅布麻葉金絲桃苷和異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

3 討論

3.1 色譜條件及提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)建立同時(shí)測(cè)定羅布麻葉藥材特征圖譜及2個(gè)黃酮類成分含量的方法，在選擇色譜條件時(shí)，考察了流動(dòng)相體系(甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸)、流動(dòng)相酸的種類(磷酸、甲酸、冰乙酸)、檢測(cè)波長(zhǎng)(275、360 nm)、色譜柱[Waters CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)]、柱溫(33、35、37 ℃)及流速(0.28、0.30、0.32 mL·min-1)的影響。最終選擇最佳色譜條件分別為乙腈-0.1%磷酸、360 nm、Waters CORTECS UPLC T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)、35 ℃、0.30 mL·min-1。

通過(guò)單因素分析，分別考察了提取溶劑用量(25、50、100 mL)、提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇)、提取方式(超聲、加熱回流)及提取時(shí)間(30、60、90、120 min)對(duì)羅布麻葉特征圖譜及含量測(cè)定的影響，以確定最佳樣品前處理方法。綜合提取效果與經(jīng)濟(jì)效率，最終確定的前處理方法為用70%甲醇50 mL，加熱回流90 min。

3.2 結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)建立了不同產(chǎn)地羅布麻葉藥材UPLC特征圖譜方法，由于峰9與峰10之間的3個(gè)峰分離度較差，純度較低，故只標(biāo)定其余16個(gè)共有峰，指認(rèn)了峰1為新綠原酸、峰2為綠原酸、峰3為隱綠原酸、峰7為金絲桃苷、峰8為異槲皮苷、峰15為槲皮素、峰16為山柰酚。各批次藥材與對(duì)照?qǐng)D譜R之間的相似度均大于0.95；聚類分析將16批藥材劃分成4類，結(jié)合主成分分析，發(fā)現(xiàn)第一、二、三、四主成分的累積方差貢獻(xiàn)率高達(dá)88.154%，該4個(gè)主成分可表示羅布麻葉藥材UPLC數(shù)據(jù)的主要信息。并針對(duì)4個(gè)主成分對(duì)羅布麻葉藥材進(jìn)行綜合得分評(píng)價(jià)，顯示河南省駐馬店市產(chǎn)地的羅布麻葉藥材排名較靠前，4個(gè)產(chǎn)地的羅布麻葉綜合排名分布較分散，說(shuō)明羅布麻葉藥材總體質(zhì)量不夠穩(wěn)定?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，羅布麻葉的主要活性成分為黃酮類成分，具有降壓、調(diào)脂、抗氧化、抗病原微生物、增強(qiáng)免疫活性、抗腫瘤等作用，其中金絲桃苷、槲皮素和異槲皮苷是羅布麻葉降血壓的主要活性物質(zhì)[14-15]。在羅布麻葉藥材UPLC特征圖譜方法的基礎(chǔ)上，由于槲皮素(峰15)峰面積較小、含量低，因此只測(cè)定了黃酮類中的主要成分金絲桃苷(峰7)和異槲皮苷(峰8)的含量。結(jié)果表明，藥材中金絲桃苷和異槲皮苷含量波動(dòng)不大，說(shuō)明不同產(chǎn)地的羅布麻葉藥材金絲桃苷和異槲皮苷含量較穩(wěn)定，差異性較小。從總含量均值來(lái)看，以安徽省阜陽(yáng)市和河南省駐馬店市產(chǎn)羅布麻葉藥材總含量較高。本研究為羅布麻葉藥材的采購(gòu)與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。