雞血血紅蛋白酶法提取血紅素工藝優(yōu)化

吳文錦，汪蘭，孫靜，丁安子，喬宇，石柳，李新*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064）

我國是家禽養(yǎng)殖大國，近年來家禽屠宰加工業(yè)得到了快速發(fā)展，產(chǎn)生大量的禽血副產(chǎn)物。目前禽血轉(zhuǎn)化利用率不到10%，通常加工為血豆腐、血粉等初級(jí)加工產(chǎn)品，大部分以污水的形式排放丟棄，導(dǎo)致蛋白質(zhì)資源流失，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。禽血中含有豐富的血漿蛋白與血紅蛋白，如進(jìn)行深度開發(fā)利用，制備具有功能特性的食品輔料，可以顯著提高家禽產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。缺鐵性貧血是全世界最常見的營養(yǎng)缺乏癥，約20%的人口尤其是婦女、兒童存在這種癥狀[2]。血紅素鐵吸收優(yōu)于非血紅素鐵，可以通過補(bǔ)充富含血紅素鐵強(qiáng)化食品來解決缺鐵性貧血[3]。血紅素與珠蛋白通過四鍵相結(jié)合構(gòu)成血紅蛋白，其中兩個(gè)是丙酸基與珠蛋白的結(jié)合鍵，另兩個(gè)是通過鐵與珠蛋白中組氨咪唑環(huán)的氮環(huán)或配位鍵結(jié)合[4]。血紅素是由卟啉和一分子的亞鐵離子結(jié)合的鐵卟啉類化合物，具有非常重要的生理生化功能，可以廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)補(bǔ)鐵劑和色素添加劑[5]。

目前關(guān)于血紅素提取制備主要采用冰醋酸法、酸性丙酮法，當(dāng)pH值低于3.5時(shí)，二價(jià)鐵離子與組氨酸配位鍵離解，導(dǎo)致血紅素分子斷開，這是酸性試劑分離血紅素的原理，但存在有機(jī)物污染的風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。應(yīng)用蛋白酶酶解提取分離血紅素，具有效果高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。有研究表明，采用超聲波、凍融、均質(zhì)等方法破壞血紅細(xì)胞形態(tài)，使血紅素更加徹底地分離，提高血紅素得率，然而這些方法不適合大批量的動(dòng)物血液處理[11-13]。本研究以新鮮雞血為原料，采用蛋白酶水解血紅蛋白，結(jié)合離心、凍干等方法制備血紅素，為提高禽血資源的高值轉(zhuǎn)化利用、減少禽血排放造成的污染提供了可行途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血：武漢市洪山區(qū)南湖生鮮市場(chǎng)。雞宰殺時(shí)收集雞血，添加0.2%乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na），攪拌均勻，置于冰盒中備用，離心處理（4 000 r/min，20 min），收集沉淀，凍干即為血紅蛋白粉。

EDTA-2Na、硝酸、高氯酸、硫酸、硼酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛、乙醇、甲酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、酚酞、硫酸鐵銨（分析純）、氯化血紅素（標(biāo)準(zhǔn)品，純度>99.99%）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酸性蛋白酶（酶活力≥50 U/mg）、中性蛋白酶（酶活力≥100 U/mg）、堿性蛋白酶（酶活力≥200 U/mg）：合肥博美生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-25MS高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L5S紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；TAS-990原子吸收分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SH220F石墨消解儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SIM FDS-2.5E真空冷凍干燥機(jī)：美國SIM公司；LC-30AD液相色譜：日本SHIMMADZU公司；Qtrap 4500質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以血紅蛋白粉為酶解底物，分別選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶酶解，根據(jù)蛋白酶最適反應(yīng)溫度、pH值調(diào)整酶解體系溫度與pH值。底物濃度分別設(shè)定為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/100 mL，蛋白酶添加量分別設(shè)定為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL，酶解時(shí)間分別設(shè)定為 3、4、5、6、7 h。研究分析蛋白酶種類、底物濃度、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)血紅蛋白水解度、血紅素得率、血紅素純度的影響。

通過單因素試驗(yàn)結(jié)果分析，確定適宜的蛋白酶種類，并選取底物濃度（A）、酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）為試驗(yàn)因素，以血紅素得率、純度為考核指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)條件。因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)水平因素表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

采用最優(yōu)酶解工藝參數(shù)酶解，離心（4 000 r/min，20 min），收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥得到血紅素產(chǎn)品，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（lipid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析確定血紅素濃度。

1.3.2 營養(yǎng)成分檢測(cè)

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[14]；蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[15]；脂肪含量測(cè)定參照 GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[16]；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》[17]；鐵含量測(cè)定參照GB 5009.90—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鐵的測(cè)定》[18]。

1.3.3 水解度（degree of hydrolysis，DH）測(cè)定

按照式（1）計(jì)算水解度。

式中：AN為甲醛電位滴定法測(cè)定[19]的氨基態(tài)氮含量，g/100 mL；TN為凱氏定氮法測(cè)定[15]的總氮量，g/100 mL。

1.3.4 血紅素得率測(cè)定

采用原子吸收分光光度法測(cè)定血紅素得率。準(zhǔn)確稱取樣品0.5 g～3.0 g于帶刻度的消化管中，加入10 mL硝酸和0.5 mL高氯酸，在電熱爐上消解（120℃/0.5 h～1 h、180℃/2 h～4 h、220℃/0.5 h～1 h），冷卻后將消化液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用少量水洗滌2次～3次，合并洗滌液于容量瓶中并定容，混勻備用。將鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液按質(zhì)量濃度由低到高的順序分別導(dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)，測(cè)定吸光度，以鐵質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.27x+0.07（R2=0.962 9）。將樣品溶液分別導(dǎo)入原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，根據(jù)鐵質(zhì)量濃度換算成血紅素質(zhì)量濃度（鐵的質(zhì)量濃度×11.0），按式（2）計(jì)算血紅素得率。

1.3.5 血紅素純度測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定血紅素純度。血紅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于波長385 nm處測(cè)定光吸收值，以血紅素濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，血紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=82.556 x-0.004（R2=0.999 3）。稱取樣品20mg于10mL容量瓶中，加入0.1mol/L NaOH溶解并定容，于波長385 nm處測(cè)定吸收值，按式（3）計(jì)算樣品中血紅素純度。

1.3.6 血紅素產(chǎn)品的質(zhì)譜分析

稱取一定量的血紅素產(chǎn)品，用5%氨水+75%水溶解，用0.22 μm微濾膜過濾，超聲波脫氣后進(jìn)行定性半定量分析。

色譜條件為色譜柱：采用 C18柱（1.8 μm，2.0 mm×75 mm）；流動(dòng)相：A相，純甲醇溶液；B相，0.02%甲酸-水溶液（體積分?jǐn)?shù)）；流速：0.25 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；色譜柱溫度：40℃；采用梯度洗脫，流速保持不變，初始 B 相為 80%，0～2 min；B 相 60%，2 min～4 min；B相 50%，4 min～6 min；A 相 100%，保持 8 min～9 min；B相80%，保持1 min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）離子化；正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM），電噴霧電壓（ionspray，IS）5 500 V，離子化溫度（temperature，TEM）300℃；霧化氣壓力（gas1，GS1）50psi（1psi=6.895kPa），輔助氣壓力（gas 2，GS2）50 psi，氣簾氣壓力（curtain gas，CUR）35 psi；定量離子對(duì) 616.1>557.2、去簇電壓（declustering potential，DP）175 V、碰撞電壓（collision energy，CE）51 V；定性離子對(duì) 616.1>498.2、DP 175 V、CE 69 V。

按式（4）計(jì)算產(chǎn)品中血紅素含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，試驗(yàn)重復(fù)3次，使用Excel、Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件檢驗(yàn)組間差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞血營養(yǎng)成分

雞血營養(yǎng)成分見表2。

表2 雞血營養(yǎng)成分Table 2 Nutrition of chicken blood

由表2可知，新鮮雞血主要成分是水，含量達(dá)到94.94%；其次是蛋白質(zhì)，含量為5.03%，主要包含血紅蛋白、肌紅蛋白、血漿蛋白；雞血脂肪含量非常少，僅為0.18%；雞血灰分含量為 0.38%，主要為 Na、Fe、Mg、Ca等礦物質(zhì)元素；雞血中鐵含量為148.78 mg/kg，鐵與卟啉環(huán)絡(luò)合，結(jié)合在卟啉環(huán)中央構(gòu)成血紅素，而血紅素是血紅蛋白、肌紅蛋白和紅細(xì)胞的輔基，是重要的天然卟啉鐵化合物[20]。雞血中含有絕大部分水，從雞血中分離提取血紅素，去除水分是關(guān)鍵，亦是影響血紅素得率、純度的主要因素。因此本文采用離心提取血液中血紅蛋白，再通過冷凍干燥得到血紅蛋白粉，以血紅蛋白粉為酶解底物，便于后續(xù)酶解工藝，也有利于提高血紅素得率和純度。

2.2 蛋白酶種類對(duì)血紅蛋白水解度的影響

以血紅蛋白為底物，選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶與酸性蛋白酶酶解，水解度見圖1。

圖1 3種蛋白酶水解度隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.1 Changes of DH of 3 proteases with time

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間延長，水解度呈增加趨勢(shì)，其中酶解2 h，水解度增加顯著，2 h后，水解度呈緩慢上升趨勢(shì)；中性蛋白酶、堿性蛋白酶水解度高于酸性蛋白酶，水解度與蛋白酶的酶活力呈正相關(guān)?？紤]堿性蛋白酶酶解過程中添加堿液調(diào)整pH值，且不利于酶解液后期處理，因此確定中性蛋白酶為雞血血紅素酶解提取專用酶。胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶都可以用于血液中血紅素提取，單一酶解或復(fù)合酶解取決于酶活力與酶解目的[21]。

2.3 底物濃度對(duì)血紅蛋白水解度與血紅素得率、純度的影響

不同底物濃度下的水解度、血紅素得率、血紅素純度見表3。

表3 不同底物濃度下的水解度、血紅素得率、血紅素純度Table 3 Changes of DH，heme yield and heme purity with different contents of substrate

由表3可知，隨著血紅蛋白濃度增加，水解度呈增加趨勢(shì)。酶解反應(yīng)液中底物濃度較低時(shí)，底物可以與酶充分接觸發(fā)生降解反應(yīng)，水解度顯著增加，隨著底物濃度增加，而酶濃度恒定時(shí)，與酶接觸發(fā)生反應(yīng)的底物只能是一定的，另外隨著酶解進(jìn)行，酶解產(chǎn)物與底物處于競(jìng)爭關(guān)系，導(dǎo)致底物不能被完全水解，水解度趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，底物濃度1.0 g/100 mL～5.0 g/100 mL時(shí)，均處于有效底物濃度范圍，即均能被蛋白酶有效降解。

底物濃度為2.0 g/100 mL時(shí)，血紅素得率達(dá)到最高值52.08%，底物濃度為3.0 g/100 mL～5.0 g/100 mL時(shí)，血紅素得率下降并趨于穩(wěn)定，分別為32.31%、32.60%、30.30%，由此可以說明，底物濃度在2.0g/100mL時(shí)，血紅蛋白中珠蛋白可以被有效降解，使血紅素游離出來。底物濃度超過2.0 g/100 mL，雖然珠蛋白與酶發(fā)生降解反應(yīng)，水解度隨之增加，但珠蛋白沒有被完全降解，使血紅素仍處于與珠蛋白（或肽）結(jié)合的狀態(tài)，血紅素得率下降。

血紅素純度隨底物濃度變化趨勢(shì)與血紅素提取率變化基本一致，底物濃度為2.0 g/100 mL時(shí)，血紅度純度達(dá)到最高值53.72%，隨著底物濃度增加，血紅度純度顯著下降，底物濃度為3.0 g/100 mL～5.0 g/100 mL時(shí)，血紅度純度分別為26.87%、25.09%、19.58%。由此可以表明，底物濃度2.0 g/100 mL時(shí)，血紅蛋白可以被徹底降解，血紅素純度最高。

2.4 酶添加量對(duì)血紅蛋白水解度與血紅素得率、純度的影響

不同酶添加量下的水解度、血紅素得率、血紅素純度見表4。

表4 不同酶添加量下的水解度、血紅素得率、血紅素純度Table 4 Changes of DH，heme yield and heme purity with different contents of enzyme

由表4可知，隨著酶添加量增加，血紅蛋白水解度整體呈緩慢增加趨勢(shì)，酶添加量為1.5 g/100 mL時(shí)，水解度為10.54%，酶添加量2.0 g/100 mL～2.5 g/100 mL時(shí)，水解度增加不明顯。由此可以推斷添加1.5 g/100 mL的酶可以有效降解底物，酶濃度繼續(xù)增加，處于過飽和狀態(tài)，而血紅蛋白濃度一定，因此底物水解度上升不明顯。酶解開始時(shí)，底物濃度、酶濃度較高，酶活性也最大，隨著酶解反應(yīng)進(jìn)行，底物濃度降低，酶活性也降低，表現(xiàn)為水解度幾乎不增加[22-23]。

隨著酶添加量增加，血紅素得率先緩慢上升后略下降，其中酶添加量為1.5 g/100 mL時(shí)，血紅素得率為最高值37.70%；酶添加量為1.5 g/100 mL～2.5 g/100 mL時(shí)，血紅素得率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)?shù)孜餄舛?、酶解反?yīng)時(shí)間一定時(shí)，酶與底物發(fā)生競(jìng)爭性水解反應(yīng)，使底物水解不徹底，導(dǎo)致血紅素得率下降。

隨著酶添加量增加，血紅素純度先增加后降低，變化趨勢(shì)與血紅素得率基本一致。酶添加量為1.5g/100 mL時(shí)，血紅素純度達(dá)到最高值31.95%，酶添加量為1.5 g/100 mL～2.5 g/100 mL時(shí)，血紅素純度下降。由此表明，酶濃度過飽和時(shí)，酶與底物發(fā)生競(jìng)爭反應(yīng)，使底物水解不完全，導(dǎo)致血紅素純度降低。

2.5 酶解時(shí)間對(duì)血紅蛋白水解度與血紅素得率、純度的影響

不同酶解時(shí)間下的水解度、血紅素得率、血紅素純度見表5。

表5 不同酶解時(shí)間下的水解度、血紅素得率、血紅素純度Table 5 Changes of DH，heme yield and heme purity with different hydrolysis time

由表5可知，隨著酶解時(shí)間的延長，血紅蛋白水解度呈平緩增加趨勢(shì)，由此表明，酶解初始階段，即酶解3 h之前，底物濃度較高，酶活性也較強(qiáng)，水解度迅速增加，當(dāng)酶解3 h后，底物濃度降低，酶活性也降低，水解度緩慢增加。延長酶解時(shí)間有利于提高水解度，但綜合考慮生產(chǎn)周期、能耗等問題，確定酶解時(shí)間5 h比較適宜。血紅素得率隨酶解時(shí)間增加呈緩慢上升后略有降低趨勢(shì)，酶解3h，血紅素得率已達(dá)到33.54%，酶解5h，血紅素得率達(dá)到最高值39.52%。由此可以推斷，血紅素得率隨著酶解時(shí)間增加達(dá)到穩(wěn)定值，表明酶解體系中底物已被徹底水解，血紅蛋白中血紅素已游離出來，再增加酶解時(shí)間，只會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白中的珠蛋白進(jìn)一步降解成小肽或氨基酸，而這一階段對(duì)血紅素得率無影響。另外，血紅蛋白自動(dòng)氧化是不可以避免的，血紅素中的亞鐵與氧氣結(jié)合生成三價(jià)鐵，使血紅素呈黑褐色，因此有必要控制酶解時(shí)間以保證血紅素品質(zhì)[24-25]。

血紅素純度隨酶解時(shí)間變化趨勢(shì)與血紅素得率變化基本一致。酶解3 h，血紅素純度達(dá)到27.47%，酶解5 h，血紅素純度達(dá)到最高值33.80%，酶解7 h，血紅素純度降低。由此表明，隨酶解時(shí)間延長，酶解體系中底物已被完全水解，使血紅素釋放出來，血紅素純度達(dá)到穩(wěn)定值，再增加酶解時(shí)間，血紅素中的鐵離子與小肽結(jié)合生成小肽鐵螯合鹽，使血紅素純度降低[26]。

2.6 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Orthogonal array experimental design and results

由表6 R值分析可知，影響血紅素得率、純度的因素主次順序均為A>B>C，即底物濃度是主要因素，其次是酶添加量，而酶解時(shí)間影響最小。k值結(jié)果表明，最優(yōu)酶解工藝條件是A3B3C3，即血紅蛋白粉濃度為4.0 g/100 mL，酶添加量 2.0 g/100 mL，酶解 6 h，在此條件下，血紅素得率與純度分別為52.76%、50.17%。鑒于酶解時(shí)間對(duì)血紅素得率與純度影響不明顯，且考慮生產(chǎn)周期問題，選擇酶解工藝條件為A3B3C1，此條件下血紅素得率與純度分別為52.23%、49.26%，與最優(yōu)工藝條件下血紅素得率、純度差異不明顯。

2.7 血紅素產(chǎn)品的質(zhì)譜分析

血紅素標(biāo)品與血紅素產(chǎn)品色譜圖見圖2、圖3。

圖2 血紅素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig 2 Chromatogram of heme standard

圖3 血紅素產(chǎn)品色譜圖Fig 3 Chromatogram of heme product

血紅素標(biāo)準(zhǔn)品與血紅素產(chǎn)品峰面積見表7。

表7 血紅素標(biāo)準(zhǔn)品與血紅素產(chǎn)品峰面積Table 7 Peak area of heme standard and product

根據(jù)確定的最優(yōu)酶解工藝水解雞血血紅蛋白，離心后沉淀經(jīng)冷凍干燥獲得雞血血紅素產(chǎn)品，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定產(chǎn)品中血紅素含量。血紅素保留時(shí)間分別為6.70、6.68 min，血紅素產(chǎn)品中血紅素保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)，由此可以判定產(chǎn)品中血紅素以氯化血紅素形式存在。根據(jù)血紅素標(biāo)準(zhǔn)品、血紅素產(chǎn)品質(zhì)量濃度與峰面積（表7）分析計(jì)算，確定產(chǎn)品中血紅素含量為50.24%。產(chǎn)品中血紅素主要以血紅素單體形式存在，血紅素與肽或蛋白類物質(zhì)結(jié)合物較少，驗(yàn)證了優(yōu)化后的酶解工藝可以有效水解血紅素-珠蛋白之間肽鍵，使血紅素釋放出來。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)探討蛋白酶種類、底物濃度、酶添加量、酶解時(shí)間對(duì)血紅蛋白水解度、血紅素得率與純度的影響，結(jié)果表明，雞血中含有大量的水分，因此酶法提取血紅素有必要以干燥血紅蛋白為底物，有利于提高血紅素得率與純度；中性蛋白酶、堿性蛋白酶酶解水解度高于酸性蛋白酶，中性蛋白酶因不需調(diào)整底物pH值更方便于血紅素提?。恢行缘鞍酌该附馓崛‰u血血紅素最優(yōu)工藝條件：血紅蛋白粉濃度4.0 g/100 mL，酶添加量2.0 g/100 mL，酶解4 h，血紅素得率與純度分別為52.23%、49.26%。應(yīng)用液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜方法確定血紅素產(chǎn)品中血紅素以氯化血紅素形式存在，含量為50.24%。雞血血紅素得率、純度與血紅蛋白中血紅素含量直接相關(guān)，而血紅素含量與屠宰過程中雞的個(gè)體差異直接相關(guān)，因此必須采用血紅蛋白大批量制樣來減少血紅素得率與純度差異變化。在工業(yè)生產(chǎn)中，家禽屠宰副產(chǎn)物——血液比較集中，因此相關(guān)設(shè)備必須與處理量相匹配，如離心、凍干、酶解等設(shè)備。本文為禽血蛋白酶水解提取血紅素提供理論數(shù)據(jù)與技術(shù)參考，實(shí)現(xiàn)家禽屠宰血液高值轉(zhuǎn)化應(yīng)用，有效解決對(duì)外排放導(dǎo)致的環(huán)境污染問題。