嬰幼兒齲病口腔微生物群失調與唾液免疫生物標志物的關系研究

紀 瑩, 吳婷婷, 王 欣, 唐 麗, 杜小沛

(遼寧省大連市口腔醫(yī)院, 1. 口腔預防科, 2. 牙體牙髓科, 遼寧 大連, 116021)

嬰幼兒齲病(ECC)是以細菌為主的多種因素導致的牙體組織發(fā)生不可逆的慢性免疫炎癥反應的一類疾病[1]。目前，采用傳統(tǒng)抗菌藥物治療齲病未得到理想效果?？谇晃⑸镌贓CC的發(fā)生及發(fā)展中可能起到了重要作用，正常的口腔生物膜系統(tǒng)中，微生物群落保持著動態(tài)平衡，一旦口腔外界環(huán)境發(fā)生變化或失衡，則會使微生物間的拮抗作用被打破，造成致病菌大量生長，影響口腔健康[2]。隨著齲病的發(fā)生、發(fā)展，牙體硬組織脫礦，膠原蛋白暴露，而與齲病相關的膠原蛋白酶主要包括基質金屬蛋白酶(MMP)和組織蛋白酶，其中MMP是一類牙組織基質中的肽酶，參與牙周雜層和齲病細胞外基質成分的降解[3]。此外, MMP還可通過蛋白水解激活或降解細胞因子和趨化因子對免疫和炎癥起到調節(jié)作用[4]。齲病的進展常伴隨免疫機制的改變，免疫反應在對抑制齲病的發(fā)生中具有重要作用，可保護牙齒硬組織免受感染[5]。本研究探討ECC口腔微生物群失調及其與唾液免疫生物標志物的關系，明確免疫功能低下與ECC發(fā)生、發(fā)展的關系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年6月本院收治的齲病患兒600例為研究對象，依據世界衛(wèi)生組織(WHO)齲齒診斷標準，將患兒分為低齲組(n=267)和高齲組(n=333)。納入標準: ① 無慢性、系統(tǒng)性疾病者; ② 近3個月內未接受過藥物治療者; ③ 半年內未使用過含氟制劑者。排除標準: ① 合并全身系統(tǒng)性疾病者; ② 合并精神疾病者; ③ 合并炎癥、免疫感染類疾病者; ④ 嚴重電解質紊亂者; ⑤ 合并惡性腫瘤者; ⑥ 具有不良飲食習慣者，如甜食攝入較多，吮吸手指等。另選取同期在本院體檢的健康嬰幼兒100例為對照組。3組性別、年齡、體質量等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 具有可比性，見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

治療前，所有入組對象于清晨使用清水漱口，然后采用無菌平板培養(yǎng)皿收集唾液樣本，并迅速分裝到EP管中，置于液氮罐中保存待用。唾液凍存前，取1 mL進行微生物檢測，記錄各組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌以及雙歧桿菌的菌落數(shù)。取唾液樣本, 3 000轉/min 離心10 min, 取上清液50 μL, 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組唾液中MMP-2、MMP-3、MMP-9水平，所用試劑盒購自美國BIOTANG公司。采用Model550全自動多功能酶標儀(美國BIO-RAD公司)及ELISA法檢測唾液中炎癥因子水平如白細胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。所用試劑盒購自美國BIOTANG公司。采用Im-mage 800全自動特定蛋白儀(美國Beckman公司)檢測唾液免疫指標，包括免疫球蛋白(Ig)(IgA、IgG)及補體C3、補體C4。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組口腔微生物群菌落數(shù)比較

高齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于低齲組和對照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于低齲組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 低齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于對照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表2。

表2 各組口腔微生物群菌落數(shù)比較 CFU/mL

2.2 各組基質金屬蛋白酶水平比較

高齲組MMP-2、MMP-3和MMP-9水平均高于低齲組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 低齲組MMP-2、MMP-3和MMP-9水平均高于對照組(P<0.05), 差異有統(tǒng)計學意義，見表3。

表3 各組MMP水平比較 μg/L

2.3 各組炎癥因子水平比較

高齲組IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于低齲組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 低齲組IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表4。

表4 各組炎癥因子水平比較 pg/mL

2.4 各組免疫功能指標比較

高齲組IgA、IgG、補體C3和補體C4水平均低于低齲組和對照組，且低齲組IgA、IgG、補體C3和補體C4水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見表5。

表5 各組免疫功能指標比較 g/L

2.5 口腔菌群與MMP、炎癥因子和免疫功能的相關性分析

Pearson相關性分析表明，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著正相關(P<0.05), 與IgA、IgG、補體C3和補體C4水平呈顯著負相關(P<0.05); 雙歧桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著負相關(P<0.05), 與IgA、IgG、補體C3和補體C4水平呈顯著正相關(P<0.05), 見表6。

表6 口腔菌群與MMP、炎癥因子和免疫功能的相關性分析

3 討 論

ECC是兒童最常見的口腔疾病，具有發(fā)生率高、進展迅速、累及廣、治療難度大等特點[6]。既往研究認為，以變異鏈球菌為代表的一系列細菌是齲病的單一致病菌，然而基于傳統(tǒng)致病菌的治療未能有效降低齲病的發(fā)生率，可見到單一致病菌理論無法完全反映疾病與微生物之間的關系?？谇恢械奈⑸飳CC的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用[7]。口腔微生物組分復雜，對口腔健康至關重要，人類口腔中有700多種微生物，主要以細菌為主?？谇晃⑸锶河兄谧柚共≡⑸锏纳L，維持口腔微生態(tài)的穩(wěn)定與平衡。微生物與宿主關系失衡會導致口腔微生態(tài)失調，誘發(fā)齲齒和牙周病等口腔疾病，導致潛在致病微生物增殖[8]。唾液中混雜了廣泛的口腔微生物，因其物理條件獨特、理化性質以及容易獲取，為口腔微生物群的研究提供了理想的條件。MA C等[9]采用變性梯度凝膠電泳對齲病唾液微生物進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，患齲組唾液微生物多樣性低于無齲組唾液微生物的多樣性。對2例剛出生的嬰兒唾液微生物研究[10]發(fā)現(xiàn)，隨著牙齒從健康到齲病，口腔微生物多樣性逐漸減少，原因可能是隨著齲病的發(fā)展和口腔pH值的逐漸下降，耐酸菌逐漸增多，影響正常口腔菌群的定植，菌群的結構呈現(xiàn)單一性，多樣性減少。FREGNANI E R等[11]通過比較無齲病和嚴重ECC兒童唾液及菌斑微生物菌群情況認為，變異鏈球菌、放線菌屬等與嚴重ECC有顯著相關性。JIANG W等[12]基于測序技術對患有不同齲病的兒童口腔微生物分析發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬、放線菌屬的豐度在嚴重ECC患兒中相對增加。本研究發(fā)現(xiàn)，高齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)明顯多于低齲組和對照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于低齲組和對照組，低齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于對照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于對照組。當齲病發(fā)生時，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌致齲微生物增加，而雙歧桿菌等益生菌減少，表明口腔微生態(tài)失調可能參與了嬰幼兒齲病的發(fā)生與發(fā)展。當然，部分患兒食欲、消化能力、胃腸道功能(便秘、腹瀉)等也可能與口腔微生態(tài)存在一定聯(lián)系。

齲病形成的機制較為復雜，主要包括以下步驟: 生物膜中致齲細菌代謝增加了酸性物質的分泌; 代謝產生的酸性物質導致pH值下降，造成牙齒脫礦; 未有效干預牙齒進一步脫礦，形成齲齒[13]; 細菌產酸進一步激活MMP降解細胞外基質，促進細菌侵襲牙齦，進一步促進齲病的發(fā)展[14]。ANTUNES L A等[15]發(fā)現(xiàn)，兒童早期齲病中MMP-9基因型出現(xiàn)率較高，且與釉質白斑的形成有關，而MMP-2、MMP-3基因型與齲病易感性相關[16]。此外, MMP可作用于促炎細胞因子、趨化因子和其他蛋白質，以調節(jié)炎癥和免疫的各個階段，其中MMP-3作為信號分子可誘導促炎性因子或誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達[17]。

在炎癥條件下，由免疫反應介導的內源性降解途徑的激活會導致破壞性細胞分子從正常細胞中釋放出來。MMP及其調節(jié)劑可以相互激活，并通過降解細胞外基質成分以及調節(jié)細胞因子和趨化因子在免疫反應中發(fā)揮重要作用[18]。免疫反應在齲齒形成過程中扮演者重要角色, IgA是人類唾液中最豐富的抗體，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)被認為是抵御黏膜表面病原體的第一道防線[19]。研究[20]表明，選擇性IgA缺乏癥患兒比健康兒童患齲病的風險更高。補體系統(tǒng)是先天性免疫應答的重要組成部分，在幫助宿主抵抗感染方面發(fā)揮核心作用，可通過過敏性休克毒素的產生、調理、病原體的溶解等多種機制增強適應性免疫應答[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，高齲組MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于低齲組和對照組，低齲組以上指標均高于對照組; 高齲組IgA、IgG、補體C3和補體C4水平均低于低齲組和對照組，低齲組IgA、IgG、補體C3和補體C4水平均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析表明，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著正相關，與IgA、IgG、補體C3和補體C4水平呈顯著負相關; 雙歧桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著負相關，與IgA、IgG、補體C3和補體C4水平呈顯著正相關。由此可見，當宿主免疫系統(tǒng)不平衡時，口腔微生物群發(fā)生改變，這些微生物可能會侵入口腔組織，誘發(fā)口腔疾病，或激活降解細胞外基質途徑，加重炎癥反應，抑制免疫功能，進一步促進疾病的發(fā)展。