青藤堿對(duì)Heymann腎炎大鼠足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及機(jī)制研究

林宜 孫玥 譚建平 朱斌 高源成 殷佳珍 王文榮 陳洪宇

膜性腎病是機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)腎小球足細(xì)胞的自身抗體，并在局部形成免疫復(fù)合物損傷足細(xì)胞而導(dǎo)致的慢性腎小球疾病，以腎小球基底膜上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫性增厚為病理特征[1]。青藤堿為中藥青風(fēng)藤的主要單體生物堿，具有明顯抗炎、免疫抑制等藥理作用[2-7]。臨床研究證實(shí)青藤堿治療慢性腎小球腎炎及IgA腎病患者有效，且不良反應(yīng)少[8-9]，但其對(duì)治療慢性腎小球疾病的作用機(jī)制尚未完全明確。本研究旨在觀察青藤堿對(duì)Heymann腎炎大鼠足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用，探討其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 體重120～140 g健康雄性SD大鼠100只，由浙江省中醫(yī)研究院提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0003]。

1.1.2 主要藥物、試劑和儀器 雷米普利片（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司，5 mg/片）。青藤堿注射液（湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，每支50 mg/2 ml）。羊抗大鼠Fx1A血清（美國(guó)Probetex有限公司，批號(hào)：PTX-002S）。GTVision Ⅲ抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒[基因科技（上海）有限公司，批號(hào)：GK500705]。抗nephrin抗體-C-terminal[艾博抗（中國(guó)香港）貿(mào)易有限公司]?？筽odocin抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：ab50339]。異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗大鼠IgG[密理博（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)：AP189F]。10%中性福爾馬林（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）。純度＞99%戊巴比妥鈉（杭州達(dá)成生物有限公司）。PBS磷酸鹽緩沖液（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。加強(qiáng)型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。100×檸檬酸組織抗原修復(fù)液（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）。羊動(dòng)物非免疫血清（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：SPKIT-B2）。病理組織漂烘儀（常州中威電子儀器有限公司）。BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)（常州中威電子儀器有限公司）。BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(tái)（常州中威電子儀器有限公司）。DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。STIATOS臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)賀利氏控股公司）。日立7180全自動(dòng)生化分析儀（株式會(huì)社日立制作所）。RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]。CM1950冷凍切片機(jī)[徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司]。BX51生物顯微鏡[奧林巴斯（中國(guó)）有限公司]。-20℃普通低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）。微波爐（格蘭仕集團(tuán)）。代謝籠（浙江省中醫(yī)研究院自制）。

1.2 方法

1.2.1 被動(dòng)型Heymann腎炎（passive Heymann nephritis,PHN）大鼠模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選取24 h尿蛋白定量＜10 mg的健康大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。禁食給水12 h，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組15只，PHN大鼠模型制作組85只。制作PHN大鼠模型：大鼠尾靜脈注射0.4 ml/100 g體重羊抗大鼠Fx1A血清（臨用前室溫融化，4℃ 3 000 r/min離心5 min，棄沉淀），30 s內(nèi)緩慢注入。對(duì)照組僅尾靜脈注射0.4 ml/100 g體重0.9%氯化鈉注射液。大鼠造模1周后留取24 h尿液，檢測(cè)24 h蛋白定量＞10 mg視為造模成功。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組和給藥方法 對(duì)造模成功的PHN大鼠，按不同給藥方案分為5組：青藤堿低、中、高劑量組（青藤堿干預(yù)組），雷米普利組，模型組，每組17只。造模后第9天開(kāi)始，對(duì)青藤堿低、中、高劑量組分別按20、40、60 mg/（kg·d）體重腹腔注射青藤堿注射液1次。雷米普利組按5 mg/（kg·d）體重給予雷米普利混懸液（現(xiàn)用現(xiàn)配，研缽充分研磨，再加入0.9%氯化鈉注射液配置成0.5 mg/ml的混懸液）灌胃1次。模型組和對(duì)照組按雷米普利組等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃1次。定期稱重，根據(jù)體重調(diào)整給藥量。給藥第10、20天，每組分別處死5只大鼠，給藥第30天處死剩余大鼠。

1.2.3 標(biāo)本采集 應(yīng)用代謝籠，留取造模后第7天，給藥后第10、20、30天大鼠的24 h尿液以測(cè)定尿蛋白濃度。測(cè)給藥后第10、20、30天大鼠體重，腹腔注射0.45%戊巴比妥鈉溶液1 ml/100 g體重進(jìn)行麻醉。血液標(biāo)本采集：剖腹暴露腹主動(dòng)脈，腹主動(dòng)脈采血1 ml至含EDTA真空采血管，輕輕搖勻，采2 ml血液至普通真空采血管。腎組織標(biāo)本采集：切取雙腎，剝離包膜，迅速切取長(zhǎng)3 mm、寬3 mm、厚1.5 mm腎臟皮質(zhì)組織2塊，浸泡于含0.9%氯化鈉溶液的離心管中，置于冷藏箱，以備免疫熒光檢查；切取長(zhǎng)3 mm、寬2 mm、厚1.5 mm腎臟皮質(zhì)組織2塊，浸泡于含3.75%戊二醛的離心管中，置于冷藏箱，以備電鏡檢查；余組織浸泡于10%甲醛溶液中，以備光鏡及免疫組織化學(xué)檢查。

1.2.4 生化指標(biāo)測(cè)定 （1）24 h尿蛋白檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀；（2）血清ALT、AST、血肌酐、白蛋白測(cè)定采用全自動(dòng)生化分析儀；（3）血白細(xì)胞測(cè)定采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。

1.2.5 腎臟病理指標(biāo)檢測(cè) 取經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后的腎臟皮質(zhì)組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成2.5μm切片，行HE、過(guò)碘雪夫酸（PAS）、過(guò)碘酸六胺銀（PASM）染色，光鏡下觀察并攝片。取經(jīng)3.75%戊二醛及2%鋨酸雙固定后的腎臟皮質(zhì)組織，丙酮梯度脫水，包埋后切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染，水洗后電鏡下觀察。處死大鼠當(dāng)天，將浸泡于0.9%氯化鈉溶液中的2塊腎臟皮質(zhì)組織進(jìn)行冷凍切片。切片后水洗，在組織上滴加FITC標(biāo)記的羊抗大鼠 IgG 50 μl/片（1∶100稀釋），將切片置于濕盒中，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱45 min。取出片子，水洗后熒光顯微鏡下攝片進(jìn)行腎臟組織免疫熒光IgG的檢測(cè)；取各組經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后的腎臟皮質(zhì)組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制成 2μm切片，67℃恒溫烤箱固定24 h，防止脫片，而后進(jìn)行免疫組化步驟，脫蠟至水，檸檬酸組織抗原修復(fù)液高火3 min，再將組織片快速放入，解凍15 min，自然冷卻。3%雙氧水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，常溫10 min。滴加山羊血清、滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染10 min，水洗，乙醇脫水、干片、封片，行podocin、nephrin免疫組化檢測(cè)。用萊卡病理圖像采集系統(tǒng)采集圖像。免疫組化、免疫熒光檢查每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)視野，采用image pro plus6.0軟件進(jìn)行分析，得到PHN大鼠腎小球內(nèi)IgG、podocin和nephrin的陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較 給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠24 h尿蛋白水平均高于對(duì)照組（均P＜0.05）；給藥第10天，青藤堿高劑量組低于模型組（P＜0.05）；給藥第20天，青藤堿中、高劑量組均低于模型組（均P＜0.05）；給藥第30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。大鼠24 h尿蛋白水平整體呈青藤堿干預(yù)組＜雷米普利組＜模型組的趨勢(shì)，青藤堿高劑量組＜青藤堿中劑量組＜青藤堿低劑量組的趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較（mg/24 h）

2.2 各組大鼠血清白蛋白水平比較 給藥第10天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠血清白蛋白水平均低于對(duì)照組（均P＜0.05），而與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。給藥第20天，模型組、青藤堿中劑量組均低于對(duì)照組（均P＜0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與模型組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），且青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。給藥第30天，模型組低于對(duì)照組（P＜0.05）；青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與對(duì)照組、模型組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。血漿白蛋白水平整體呈對(duì)照組＞青藤堿干預(yù)組＞雷米普利組＞模型組的趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清白蛋白水平比較（g/L）

2.3 各組大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比較 給藥第10、20、30天，各組大鼠血清肌酐、血WBC、血清ALT、血清AST水平比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均 P＞0.05），見(jiàn)表 3～6。

表3 各組大鼠血清肌酐水平比較（μmol/L）

表4 各組大鼠血WBC水平比較（×109/L）

表5 各組大鼠血清ALT水平比較（U/L）

表6 各組大鼠血清AST水平比較（U/L）

2.4 模型組與對(duì)照組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化比較 對(duì)照組大鼠腎臟組織病理切片光鏡下未見(jiàn)明顯異常。模型組大鼠腎臟組織病理切片光鏡下見(jiàn)腎小球結(jié)構(gòu)清晰，毛細(xì)血管襻開(kāi)放較好，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)未見(jiàn)明顯增生，可見(jiàn)腎小球基底膜增厚伴釘突形成，基底膜空泡變性。見(jiàn)圖1-3（插頁(yè)）。模型組大鼠腎臟組織行電鏡下觀察見(jiàn)造模第30天后，大鼠腎臟組織可見(jiàn)較多散在的大小不等的電子致密物在腎小球基底膜內(nèi)、上皮細(xì)胞下沉積，基底膜不均勻增厚，釘突形成，足細(xì)胞足突廣泛融合。見(jiàn)圖4。

圖1 模型組與對(duì)照組大鼠腎臟組織HE染色病理學(xué)變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖2 模型組與對(duì)照組大鼠腎臟組織過(guò)碘雪夫酸（PAS）染色病理學(xué)變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖3 模型組與對(duì)照組大鼠腎臟組織過(guò)碘酸六胺銀（PASM）染色病理學(xué)變化（a為正常組；b為造模第20天后模型組；c為造模第30天后模型組；d為造模第40天后模型組；×400）

圖4 模型組大鼠造模第30天后腎臟組織電鏡下病理學(xué)變化所見(jiàn)（×5 000）

2.5 各組大鼠腎臟組織IgG沉積情況比較 對(duì)照組大鼠腎臟組織免疫熒光檢查示無(wú)IgG沉積。青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟免疫熒光檢查均可見(jiàn)IgG沿腎小球毛細(xì)血管襻呈彌漫、顆粒狀沉積，且給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟組織免疫熒光IgG陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表7。

表7 各組大鼠腎臟免疫熒光IgG陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度比較

2.6 各組大鼠腎臟組織podocin蛋白表達(dá)情況比較 各組大鼠腎臟組織免疫組化檢查均可見(jiàn)podocin蛋白沿腎小球毛細(xì)血管襻表達(dá)。給藥第10、20、30天，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠腎臟組織免疫組化podocin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度均低于對(duì)照組（均P＜0.05），而青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組各組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；給藥第20天，青藤堿高劑量組高于模型組（P＜0.05）。podocin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度整體呈對(duì)照組＞青藤堿治療組＞雷米普利組＞模型組的趨勢(shì)。見(jiàn)表8。

表8 各組大鼠腎臟組織蛋白podocin免疫組化陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度

2.7 各組大鼠腎臟組織nephrin蛋白表達(dá)情況比較 各組腎臟免疫組化檢查均可見(jiàn)nephrin沿腎小球毛細(xì)血管襻表達(dá)。免疫組化nephrin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度的統(tǒng)計(jì)分析：給藥第10天，模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組低于對(duì)照組（P＜0.05）；各治療組與模型組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；各青藤堿治療組之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第20天，模型組、青藤堿低劑量組低于對(duì)照組（P＜0.05），青藤堿高劑量組高于模型組（P＜0.05），各青藤堿治療組之間亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥第30天，各組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。各組nephrin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度整體呈對(duì)照組＞青藤堿干預(yù)組＞雷米普利組＞模型組的趨勢(shì)。見(jiàn)表9。

表9 各組大鼠腎臟組織蛋白nephrin免疫組化陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度比較

3 討論

中老年膜性腎病使用常規(guī)西藥糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞毒藥物等治療不良反應(yīng)較為常見(jiàn)，而中醫(yī)藥治療膜性腎病有較好效果。中藥青風(fēng)藤自古用于風(fēng)濕病的治療，具有抗炎、免疫抑制作用[2，10]。青藤堿為青風(fēng)藤的主要單體生物堿，研究發(fā)現(xiàn)其具有抗炎及免疫抑制作用[11-18]，具有腎臟保護(hù)作用[19-29]。

本研究通過(guò)尾靜脈注射羊抗大鼠Fx1A血清，成功建立PHN模型。結(jié)果表明，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組、模型組大鼠24 h尿蛋白水平均高于對(duì)照組；給藥第10天，青藤堿高劑量組24 h尿蛋白水平低于模型組；給藥第20天，青藤堿中、高劑量組24 h尿蛋白水平均低于模型組。24 h尿蛋白水平整體呈青藤堿干預(yù)組＜雷米普利組＜模型組的趨勢(shì)，青藤堿高劑量組＜青藤堿中劑量組＜青藤堿低劑量組的趨勢(shì)。與之相應(yīng)，隨著24 h尿蛋白水平下降，血漿白蛋白水平上升，可見(jiàn)青藤堿可減少Heymann大鼠尿蛋白排泄。

膜性腎病的尿蛋白主要與自身足細(xì)胞抗原介導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有關(guān)，免疫病理學(xué)檢查顯示上皮下免疫復(fù)合物沉積。本研究觀察腎臟組織IgG沉積，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組與模型組之間，青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組之間腎臟組織IgG沉積情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此可見(jiàn)，青藤堿并未減少局部免疫復(fù)合物沉積。既往研究表明青藤堿可上調(diào)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎臟足細(xì)胞nephrin和podocin表達(dá)[30]。由此，筆者推測(cè)青藤堿也可能通過(guò)干預(yù)Heymann大鼠足細(xì)胞蛋白分子的表達(dá)起到保護(hù)作用。免疫組化檢測(cè)podocin表達(dá)，顯示青藤堿低、中、高劑量組和雷米普利組大鼠腎臟組織podocin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度顯著低于對(duì)照組；給藥第20天，青藤堿高劑量組高于模型組。各組podocin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度整體呈對(duì)照組＞青藤堿干預(yù)組＞雷米普利組＞模型組的趨勢(shì)。nephrin的表達(dá)結(jié)果表明，給藥第10天，模型組、青藤堿低劑量組、青藤堿中劑量組顯著低于對(duì)照組；給藥第20天，模型組、青藤堿低劑量組顯著低于對(duì)照組，青藤堿高劑量組顯著高于模型組，各組nephrin陽(yáng)性區(qū)平均積分光密度整體呈對(duì)照組＞青藤堿干預(yù)組＞雷米普利組＞模型組的趨勢(shì)。由于足細(xì)胞中podocin、nephrin分子是組成足細(xì)胞足突裂孔隔膜的縫隙蛋白，是構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障重要組成部分，這些裂孔膜蛋白的缺失或者突變會(huì)導(dǎo)致尿蛋白。由此可見(jiàn)，青藤堿可能通過(guò)上調(diào)PHN大鼠腎臟組織podocin、nephrin的表達(dá)，修復(fù)足細(xì)胞損傷，減少尿蛋白排泄。

此外，本研究中所用青藤堿劑量在治療PHN大鼠過(guò)程中無(wú)明顯肝腎功能、骨髓的影響。在觀察青藤堿療效的同時(shí)，對(duì)其神經(jīng)系統(tǒng)改變進(jìn)行觀察。青藤堿治療組大鼠腹腔注射后較其他組大鼠表現(xiàn)出短暫性行動(dòng)遲緩，推測(cè)與青藤堿的鎮(zhèn)靜作用有關(guān)，未見(jiàn)抽搐等神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)；可見(jiàn)本研究中腹腔注射青藤堿劑量對(duì)PHN大鼠無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示青藤堿可通過(guò)上調(diào)PHN大鼠腎臟組織podocin、nephrin的表達(dá)，修復(fù)足細(xì)胞損傷以減少PHN大鼠尿蛋白排泄，且其干預(yù)作用具有劑量依賴效應(yīng)，即劑量越大，干預(yù)尿蛋白的效果越明顯，且本研究中并未見(jiàn)到明顯的不良反應(yīng)。