馮穎 王芊芊 王沖 程兆俊 周文靜 章道會(huì) 費(fèi)小陽(yáng)
在輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)周期中促排卵藥物的使用實(shí)質(zhì)上是對(duì)患者添加外源性激素。而性激素水平的改變與各時(shí)期女性的焦慮、抑郁狀態(tài)息息相關(guān)[1-2]。研究表明,焦慮狀態(tài)可以降低施行ART患者的獲卵數(shù)、正常受精率、優(yōu)胚率、妊娠率和胚胎種植率[3-4]。然而,目前關(guān)于促排卵藥物引起患者焦慮行為及對(duì)生育力的影響研究少見(jiàn)。本研究擬通過(guò)促排卵C7BL/6J近交系小鼠,模擬機(jī)體外源性接受超排卵藥物狀態(tài),并通過(guò)高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實(shí)驗(yàn),利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開(kāi)臂的恐懼心理,形成動(dòng)物的矛盾沖突來(lái)評(píng)估動(dòng)物的焦慮行為[5-6];再進(jìn)行體外受精實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步分析不同劑量促排卵藥物對(duì)小鼠卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量的影響,以期為ART周期中制定合理劑量的促排卵方案,減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力,改善生育結(jié)局提供參考。
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡SPF級(jí)C57BL/6J雌鼠,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,按照SFP級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)浙江大學(xué)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展(ZJU20200135)。
1.1.2 主要儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用儀器為EPM,Any-maze動(dòng)物行為分析系統(tǒng)6.0(美國(guó)Stoelting公司),體式解剖鏡(日本Olympus公司,型號(hào):SZ61),相差顯微鏡(日本Nikon公司,型號(hào):SM2645)等。所用試劑為注射用孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠(chǎng),5000 U/瓶)、絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠(chǎng),5000 U/瓶)等。
1.2 方法
1.2.1 小鼠轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 48只4周齡的C57BL/6J雌鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,每天撫觸適應(yīng)環(huán)境,進(jìn)行編號(hào)。用Panlab小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞測(cè)試儀(美國(guó)Harvard Apparatus公司,型號(hào):LE8205)對(duì)每只小鼠進(jìn)行檢測(cè),設(shè)置轉(zhuǎn)速為20 r/min,時(shí)間為 5 min。觀(guān)察小鼠在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動(dòng),以此評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力。
1.2.2 小鼠EPM實(shí)驗(yàn) 將小鼠逐只放入EPM測(cè)試箱中,實(shí)驗(yàn)人員在距離測(cè)試箱1 m處觀(guān)察記錄下述指標(biāo):(1)進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù);(2)開(kāi)臂滯留時(shí)間;(3)進(jìn)入閉臂次數(shù);(4)閉臂滯留時(shí)間。每只小鼠測(cè)試5 min。將48只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組(5、7.5、10、15 U劑量組),每組12只。促排卵前1 d下午4:00,4組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.2 ml,30 min后,進(jìn)行EPM實(shí)驗(yàn),記錄數(shù)據(jù);促排卵當(dāng)天下午4:00,4組小鼠分別腹腔注射5、7.5、10、15 U的PMSG 0.2 ml[7](將PMSG加入0.9%氯化鈉溶液稀釋配用),48 h后注射相同劑量的hCG(將hCG加入0.9%氯化鈉溶液稀釋配用),30 min后進(jìn)行EPM實(shí)驗(yàn),記錄數(shù)據(jù)。
1.2.3 小鼠體外受精實(shí)驗(yàn)
1.2.3.1 卵母細(xì)胞采集 4組小鼠注射hCG 15 h后采用頸椎脫臼法處死,剖腹取出輸卵管放入盛有配子準(zhǔn)備液(modified human tubal fluid medium,mHTF)的表面皿中,顯微鏡下放入礦物油中,找到輸卵管膨大部,用解剖針稍刺破膨大部,將卵母細(xì)胞團(tuán)引出,并導(dǎo)入到mHTF培養(yǎng)滴(取卵前1 d,用直徑35 mm的培養(yǎng)皿做好,石蠟油覆蓋,放入37℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h)。
1.2.3.2 精子采集 取交配過(guò)的性成熟C57BL/6J雄鼠1只,頸椎脫臼法處死,剪下附睪的上體部,用注射針刺破,擠出精子團(tuán)放入mHTF培養(yǎng)滴中,CO2培養(yǎng)箱中放置1 h再行體外受精。
1.2.3.3 體外受精 將培養(yǎng)1 h的精子懸浮液在鏡下檢查精子活力和精子數(shù)量,然后用移液器按每個(gè)培養(yǎng)滴10μl精子懸浮液移入卵母細(xì)胞滴(每只小鼠卵母細(xì)胞單獨(dú)放 1滴),將精子終濃度調(diào)至(2~4)×106個(gè)/ml,放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),6 h后取出,用移卵管將受精卵移入新的mHTF培養(yǎng)滴中清洗兩次,放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
1.2.3.4 早期胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià) 培養(yǎng)24 h后的受精卵做鏡檢,統(tǒng)計(jì)胚胎數(shù)、未受精卵及異常卵數(shù)。其中,正常胚胎和未受精卵形態(tài)正常,具有完整的透明帶,不含空泡和碎片,細(xì)胞質(zhì)明亮均一。未受精卵細(xì)胞不分裂。死亡卵顏色發(fā)暗并帶有細(xì)胞質(zhì)顆粒;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有碎片、部分細(xì)胞質(zhì)溶解的卵為畸形卵;死亡卵和畸形卵都屬于異常卵[8]。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件;計(jì)量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn),組內(nèi)促排卵前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 小鼠運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估 適應(yīng)性飼養(yǎng)期間小鼠體格正常、毛色光亮、行為活動(dòng)正常。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)顯示本實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)能力均無(wú)異常。
2.2 EPM實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 總體活動(dòng)情況 4組小鼠促排卵前、后總進(jìn)臂(進(jìn)入開(kāi)臂+進(jìn)入閉臂)次數(shù)比較見(jiàn)表1。
表1 4組小鼠促排卵前、后總進(jìn)臂次數(shù)比較(次)
由表1可見(jiàn),組內(nèi)比較,4組小鼠促排卵后總進(jìn)臂次數(shù)均較促排卵前減少(均P<0.05)。組間比較,促排卵前4組小鼠總進(jìn)臂次數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);促排卵后,15 U劑量組小鼠總進(jìn)臂次數(shù)明顯少于5 U劑量組、7.5 U劑量組(均P<0.05)。即促排卵會(huì)引起小鼠焦慮行為,且劑量越高,焦慮行為越明顯。
2.2.2 開(kāi)臂活動(dòng)情況 4組小鼠促排卵前、后進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間比較見(jiàn)表2。
由表2可見(jiàn),組內(nèi)比較,4組小鼠促排卵后進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間均較促排卵前減少(均P<0.05)。組間比較,促排卵前4組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);促排卵后,10 U、15 U劑量組小鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間均明顯少于5 U劑量組、7.5 U劑量組(均P<0.05)。
表2 4組小鼠促排卵前、后進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間比較
2.2.3 閉臂活動(dòng)情況 4組小鼠促排卵前、后進(jìn)入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時(shí)間比較見(jiàn)表3。
由表3可見(jiàn),組內(nèi)比較,7.5 U劑量組、15 U劑量組小鼠促排卵后進(jìn)入閉臂次數(shù)均較促排卵前減少(均P<0.05),10U劑量組小鼠促排卵后閉臂滯留時(shí)間較促排卵前增加(P<0.05)。組間比較,促排卵前4組小鼠進(jìn)入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時(shí)間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);促排卵后,10 U劑量組小鼠閉臂滯留時(shí)間明顯長(zhǎng)于5 U劑量組、7.5 U劑量組(均P<0.05)。
表3 4組小鼠促排卵前、后進(jìn)入閉臂次數(shù)和閉臂滯留時(shí)間比較
2.3 4組小鼠體外受精結(jié)果比較 見(jiàn)表4。
由表4可見(jiàn),4組小鼠平均卵母細(xì)胞數(shù)、異常卵率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),10 U劑量組卵母細(xì)胞數(shù)高于5 U劑量組、7.5 U劑量組、15 U劑量組(均P<0.05),且異常卵率較5 U劑量組和7.5 U劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。15 U劑量組卵母細(xì)胞數(shù)明顯低于其他3組(均P<0.05),且異常卵率最高,明顯高于其他3組(均P<0.05)。這表明10 U劑量可以獲得最多的卵母細(xì)胞,且不增加異常卵率,更高劑量的促排藥物反而會(huì)抑制卵泡的發(fā)育。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),10 U劑量組的受精率明顯高于5 U劑量組(P<0.05),10 U劑量組的體外受精平均胚胎數(shù)也最高,明顯高于其他3組(均P<0.05),而15 U劑量組平均胚胎數(shù)最低,明顯低于其他3組(均P<0.05)。這表明10 U劑量可以獲得最多的胚胎。
表4 4組小鼠體外受精結(jié)果比較
本研究發(fā)現(xiàn)促排卵藥物刺激會(huì)使小鼠產(chǎn)生焦慮行為,同時(shí)過(guò)量的促排卵藥物對(duì)卵子質(zhì)量也有影響。宗紹波等[9]指出,EPM中總進(jìn)臂次數(shù)、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間的復(fù)測(cè)性度較高,更能體現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物趨近-規(guī)避沖突的行為結(jié)果,是評(píng)價(jià)動(dòng)物焦慮表現(xiàn)的主要指標(biāo)。因此,本研究重點(diǎn)分析了以上數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)最低5 U劑量組和最高15 U劑量組小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)、進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)和開(kāi)臂滯留時(shí)間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明,促排卵藥物會(huì)使小鼠會(huì)產(chǎn)生焦慮行為,而且隨著劑量的增加,小鼠焦慮行為更甚。其他研究者也發(fā)現(xiàn),C57BL/6J雌鼠雌激素水平的改變會(huì)影響小鼠的焦慮狀態(tài)[10];而在老年的C57BL/6J雌鼠中添加雌激素可以改善小鼠的焦慮及抑郁狀態(tài)[11]。
PMSG/hCG和雌激素均可以在卵泡發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此本研究通過(guò)體外受精實(shí)驗(yàn),研究了促排卵藥物對(duì)小鼠生育力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),各組小鼠平均卵母細(xì)胞數(shù)和平均胚胎數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中,10 U劑量組平均卵母細(xì)胞數(shù)、平均胚胎數(shù)均顯著高于其他3組,可能為C57BL/6J小鼠最佳超排劑量。而增加促排卵藥物劑量至15 U后,小鼠平均卵母細(xì)胞數(shù)和平均胚胎數(shù)均下降。此外,不同劑量促排卵后小鼠異常卵率也存在差異;其中,15 U劑量組小鼠異形卵率最高。因此筆者推測(cè),隨著促排卵藥物劑量的增加,小鼠卵細(xì)胞的質(zhì)量明顯下降,異常卵數(shù)和異常卵裂率均上升。Ertzeid等[12]也提出,卵巢刺激會(huì)損害小鼠卵母細(xì)胞/胚胎質(zhì)量以及子宮環(huán)境,因此筆者提倡使用較小劑量的PMSG/hCG對(duì)小鼠進(jìn)行促數(shù)排卵。
綜上所述,PMSG/hCG促排卵藥物會(huì)使小鼠產(chǎn)生焦慮行為,并且隨著促排卵藥物劑量的增加焦慮行為也更明顯;此外,高劑量的促排卵藥物會(huì)降低卵細(xì)胞的質(zhì)量,增加異常卵的風(fēng)險(xiǎn)。本研究為ART中促排卵藥物對(duì)患者情緒的影響提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù),也為制定合理劑量的促排卵方案提供參考。