丙溴磷對(duì)映異構(gòu)體在柑橘中的殘留分析及選擇性降解

董 超, 李 晶, 楊 秦, 張耀海, 趙其陽(yáng), 焦必寧

(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶 400712)

在中國(guó)生產(chǎn)銷售的化學(xué)農(nóng)藥中，手性農(nóng)藥所占比例接近40%，且這一比例隨著新化合物的不斷研發(fā)仍在持續(xù)增加[1]。手性農(nóng)藥不同對(duì)映異構(gòu)體的活性、毒性及其在生物體和環(huán)境中的降解存在顯著差異[2-3]，而目前考察手性農(nóng)藥對(duì)人類健康和環(huán)境安全的影響時(shí)，通常沒(méi)有區(qū)分對(duì)映異構(gòu)體差別，導(dǎo)致手性農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估不夠準(zhǔn)確和全面，進(jìn)而給人類和環(huán)境帶來(lái)諸多隱患[4]。為此，從對(duì)映體水平建立手性農(nóng)藥殘留分析方法，研究其在作物及環(huán)境中的選擇性降解行為規(guī)律，是對(duì)傳統(tǒng)農(nóng)藥殘留研究方法的重要補(bǔ)充。

丙溴磷 (profenofos) 是由汽巴-嘉基公司開(kāi)發(fā)的高活性有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑[5]，因其對(duì)柑橘紅蜘蛛具有良好的防治效果而在柑橘產(chǎn)業(yè)中廣泛使用，但其在柑橘中降解緩慢，殘留檢出率較高，給柑橘水果的食用安全和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展造成了較為嚴(yán)重的威脅[6]。而丙溴磷屬于手性農(nóng)藥，存在一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體 (圖式1)。

目前，丙溴磷仍以外消旋體形式生產(chǎn)、銷售及使用，有關(guān)其在柑橘等水果中的殘留降解研究已有較多報(bào)道[7-9]，但均集中于外消旋體水平。有研究表明：(?)-丙溴磷對(duì)于大型蚤Daphnia magna24 h的急性毒性顯著大于 (+)-丙溴磷 (EC50分別為0.67和4.38 μg/L)[10]；(?)-丙溴磷對(duì)家蠅的毒殺活性也顯著高于其對(duì)映體 (LD50分別為6 μg/g和23 μg/g)[11]；丙溴磷對(duì)映體在土壤中存在選擇性降解，其中 (+)-丙溴磷在天津堿性黃土和武漢堿性紅土中的降解速率快于 (?)-丙溴磷[12]。因此，有必要從對(duì)映體角度研究丙溴磷的環(huán)境行為。

鑒于此，本文以丙溴磷為研究對(duì)象，在反相模式下優(yōu)化其對(duì)映體分離條件，確定其出峰順序，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (HPLC-MS/MS)，建立了丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的殘留分析方法；進(jìn)一步通過(guò)田間試驗(yàn)，考察并比較了其在柑橘中選擇性降解行為的差異。旨在為系統(tǒng)開(kāi)展手性農(nóng)藥丙溴磷在柑橘上降解的立體選擇性行為研究提供數(shù)據(jù)支持，也為全面開(kāi)展其在柑橘上降解安全評(píng)價(jià)研究提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LC-30AD HPLC+AB Qtrap 6500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)儀 (美國(guó)AB SCIEX公司)；Sigma3-15K臺(tái)式冷凍離心機(jī) (德國(guó)Sigma公司)；CK2000高通量組織研磨儀 (北京托摩根公司)。手性柱Lux Cellulose-1、Lux Amylose-2、Lux Cellulose-3及Lux Cellulose-4購(gòu)自美國(guó)菲羅門公司，手性柱ND(2)-RH、NS(2)-RH及NZ(2)-RH購(gòu)自廣州菲羅門公司，具體參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 七種商品化的多糖類手性固定相色譜柱Table 1 Seven different kinds of chiral column of polysaccharide-based chiral stationary phases

丙溴磷外消旋體標(biāo)準(zhǔn)品 (純度99.9%，德國(guó)Dr公司)；甲醇和乙腈 (色譜純，德國(guó)Sigma-Aldrich公司)；乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA) 和石墨化炭黑(GCB)(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；4種不同內(nèi)徑規(guī)格的多壁碳納米管 (內(nèi)徑為8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) (中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)公司)；有機(jī)相針式過(guò)濾器 (0.22 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 殘留分析方法

1.2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：采用手性柱ND(2)-RH，柱溫35 ℃，流動(dòng)相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30，采用等度洗脫模式，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。在該條件下，(+)-丙溴磷和 (?)-丙溴磷的保留時(shí)間分別為19.49和22.00 min。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子 (ESI) 源，正離子模式。氣簾氣 (CUR) 137.9 kPa，碰撞器 (CAD)Medium，離子化電壓 (IS) 5 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器 (GS1) 344.7 kPa，輔助加熱器 (GS2)344.7 kPa。將m/z374.9 ＞ 304.9和374.9 ＞ 347.2分別用于定量和定性分析，質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 丙溴磷檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of profenofos determination

1.2.2 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取5.0 g柑橘樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL乙腈，垂直振蕩5 min后加入2.0 g無(wú)水硫酸鎂及0.5 g氯化鈉垂直振蕩1 min，于10 000 r/min下離心5 min。取1.5 mL上清液，加入含有10 mg多壁碳納米管(內(nèi)徑為10～20 nm) 的2 mL離心管中，渦旋1 min，于4 000 r/min下離心5 min。取上清液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相針式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱取外消旋丙溴磷標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10.0 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成1 000.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于 –50 ℃避光保存。用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000和5 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。稱取空白樣品，按1.2.2節(jié)方法進(jìn)行前處理后獲得空白基質(zhì)液，分別配制質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200和500 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 田間試驗(yàn)

于2019年9月在西南大學(xué)農(nóng)藥殘留試驗(yàn)基地，使用50%丙溴磷乳油以有效成分質(zhì)量濃度為250 mg/L (最高推薦劑量) 的劑量在溫州蜜柑上均勻噴霧施藥1次。選取4棵生長(zhǎng)狀態(tài)、大小接近的柑橘樹(shù)設(shè)置1個(gè)試驗(yàn)小區(qū)。在處理小區(qū)相鄰位置設(shè)置1個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，小區(qū)間設(shè)隔離帶。分別于施藥后2 h和1、3、5、7、10、15、20、30、40 d采樣，每次制全果樣品3份。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 降解動(dòng)態(tài)分析 通過(guò)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程(1)擬合丙溴磷2個(gè)對(duì)映體在柑橘中的殘留降解動(dòng)態(tài)，通過(guò)半衰期 (t1/2) 表示降解速率(2)。

式中：ct代表時(shí)間t時(shí)分析物的殘留量，mg/kg；c0代表施藥后分析物的原始沉積量，mg/kg；k代表消解系數(shù)；t代表施藥后時(shí)間，d。

1.4.2 丙溴磷選擇性降解評(píng)價(jià) 采用對(duì)映體分?jǐn)?shù)(enantiomer fraction，EF) 來(lái)評(píng)價(jià)丙溴磷在柑橘中的立體選擇性降解，按 (3) 式計(jì)算。

式中：C+代表 (+)-丙溴磷的殘留濃度，C?代表 (?)-丙溴磷的殘留濃度。

1.4.3 分離參數(shù)計(jì)算 容量因子k' = (tn?t0)/t0；分離因子α=kn+1'/kn'；分離度Rs = 2(tn+1?tn)/(wn+1+wn)；其中t0為死時(shí)間，tn+1及tn分別為兩相鄰洗脫峰的保留時(shí)間，wn+1及wn分別為兩相鄰洗脫峰的基線峰寬[13]。

1.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng) (matrix effects，Me)是指共流出物影響分析物的離子化效率，使其分析信號(hào)增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象。按 (4) 式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

(4)式中：km代表基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，ks代表溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)Me為正值時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)Me為負(fù)值時(shí)為基質(zhì)減弱效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)在?20%～20%之間為弱基質(zhì)效應(yīng)；在?50%～ ?20%和20%～50%之間為中等基質(zhì)效應(yīng)；超過(guò) ?50%或50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙溴磷對(duì)映體拆分條件優(yōu)化

2.1.1 不同手性固定相對(duì)丙溴磷對(duì)映體分離的影響 在兩種流動(dòng)相組成條件下 [V(甲醇) :V(水) =70 : 30及V(乙腈) :V(水) = 40 : 60]，分別考察了7種不同手性固定相對(duì)丙溴磷對(duì)映體的拆分性能。結(jié)果顯示：ND(2)-RH柱 [固定相為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)] 表現(xiàn)出最佳的拆分性能，在兩種流動(dòng)相組成條件下均可實(shí)現(xiàn)丙溴磷對(duì)映體的基線分離 (圖1)，而其余手性固定相均未能實(shí)現(xiàn)該分離。

2.1.2 流動(dòng)相組成及溫度對(duì)丙溴磷對(duì)映體分離的影響 在確定了最佳固定相后，首先考察了改性劑種類 (甲醇、乙腈) 對(duì)于丙溴磷對(duì)映體拆分的影響。結(jié)果顯示，2種改性劑均可實(shí)現(xiàn)丙溴磷對(duì)映體的基線分離，但甲醇具有更高的洗脫效率，可實(shí)現(xiàn)對(duì)丙溴磷對(duì)映體的快速分析。

其次以甲醇為改性劑，考察了流動(dòng)相中甲醇所占體積比對(duì)丙溴磷拆分的影響。結(jié)果 (表3) 表明，隨著流動(dòng)相中甲醇比例的降低，容量因子k值、選擇性因子α及分離度Rs逐漸增加，在流動(dòng)相為V(甲醇) :V(水) = 70 : 30時(shí)可實(shí)現(xiàn)丙溴磷對(duì)映體的基線分離 (Rs = 1.51)。

在確定了最佳流動(dòng)相組成后，考察了不同柱溫對(duì)丙溴磷拆分的影響。結(jié)果 (表3) 表明，隨著柱溫升高，容量因子k值呈下降趨勢(shì)，選擇性因子α及分離度Rs逐漸增加。通過(guò)比較分離度，在該試驗(yàn)條件下僅有柱溫為35 ℃及40 ℃時(shí)分離度大于1.5，可實(shí)現(xiàn)丙溴磷對(duì)映體的基線分離，考慮到手性柱使用壽命 (推薦使用溫度小于40 ℃)，選擇柱溫為35 ℃進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表3 流動(dòng)相中甲醇所占體積比和柱溫對(duì)ND(2)-RH柱上丙溴磷對(duì)映體分離的影響Table 3 Effects of volume proportion of methanol in mobile phase and column temperatures on the enantiomeric separation of profenofos on ND(2)-RH column

2.1.3 丙溴磷對(duì)映體出峰順序 為準(zhǔn)確確定丙溴磷對(duì)映體在ND(2)-RH柱出峰順序，首先通過(guò)分離制備。獲得丙溴磷光學(xué)純單體，并通過(guò)旋光檢測(cè)器對(duì)其旋光方向進(jìn)行確認(rèn)；然后在流動(dòng)相V(甲醇) :V(水) = 70 : 30、流速0.2 mL/min及柱溫35 ℃條件下，經(jīng)ND(2)-RH柱先后進(jìn)樣檢測(cè)。如圖2所示，在上述條件下，(+)-丙溴磷對(duì)映體在ND(2)-RH柱上優(yōu)先出峰。

2.2 前處理凈化條件優(yōu)化

柑橘樣品成分復(fù)雜，易產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，從而顯著影響分析的靈敏度。多壁碳納米管(Carbon nanotubes，MWCNTs) 是1991年Iijima發(fā)現(xiàn)的一種新型碳材料，因其獨(dú)特的納米中空結(jié)構(gòu)以及比表面積較大而在農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域引起高度關(guān)注[15]。本文參考Li等[16]方法，綜合比較了9種不同組合凈化劑對(duì)丙溴磷對(duì)映體回收率的影響。由圖3中可以看出，對(duì)于丙溴磷2個(gè)對(duì)映體而言，分別以100 mg GCB、50 mg GCB和50 mg GCB+50 mg PSA為凈化劑，丙溴磷對(duì)映體的回收率均小于70%；而以10 mg 4種不同內(nèi)徑規(guī)格 (內(nèi)徑分別為8～10 nm、10～20 nm、20～30 nm和30～50 nm) 的多壁碳納米管、以50 mg PSA及100 mg PSA為凈化劑，丙溴磷對(duì)映體回收率均大于70%，且內(nèi)徑為10～20 nm的多壁碳納米管回收率最高，大于80%。通過(guò)回收率的比較，最終選擇內(nèi)徑為10～20 nm的多壁碳納米管作為最優(yōu)凈化劑。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng) 從表4可以看出，丙溴磷對(duì)映體的基質(zhì)效應(yīng)在 ?20%～20%之間，在全果中表現(xiàn)出基質(zhì)減弱效應(yīng)，在果肉中表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。由于基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，但本文為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液為基準(zhǔn)進(jìn)行了校正。

2.3.2 方法的線性范圍和靈敏度 由表4中可以看出：在2.5～250 μg/L線性范圍內(nèi)，丙溴磷對(duì)映體的全果及果肉基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r) 為0.999 6～0.999 9。以滿足農(nóng)殘分析回收率要求的最低添加水平為方法定量限 (LOQ)，丙溴磷對(duì)映體的LOQ為5 μg/kg。

表4 丙溴磷對(duì)映體的線性范圍Table 4 The linear range of the enantiomers of profenofos

2.3.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度 取空白柑橘全果及果肉樣品進(jìn)行3個(gè)水平 (10、200、1 000 μg/kg) 的添加回收試驗(yàn) (單一對(duì)映體為5、100、500 μg/kg)，每個(gè)水平重復(fù)5次，按本方法進(jìn)行測(cè)定。由表5可知，丙溴磷對(duì)映體的回收率為76%～83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為2.6%～6.0%。方法回收率和精密度良好，適用于柑橘中丙溴磷對(duì)映體的分析。

表5 丙溴磷對(duì)映體的添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 5 Recoveries and RSD of profenofos enantiomers

2.4 丙溴磷在柑橘中立體選擇性降解評(píng)價(jià)

在田間試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的降解規(guī)律符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程 (圖4-A及圖4-B)，其降解方程及半衰期見(jiàn)(表6)。通過(guò)計(jì)算對(duì)映體之間的EF值 (圖4-C)，發(fā)現(xiàn)丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的EF值均小于0.5，且整體上隨著時(shí)間呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在施藥后30 d最低，為0.43。表明丙溴磷對(duì)映體在柑橘中存在明顯的選擇性降解，(?)-丙溴磷易產(chǎn)生富集作用。

表6 柑橘全果中丙溴磷對(duì)映體的降解方程Table 6 Degradation equations of profenofos enantiomers in the whole fruit of citrus

手性農(nóng)藥在植物中發(fā)生選擇性降解可能是由于植物中眾多酶系的作用[2]，例如脂肪酶是一種廣泛存在于植物組織中的水解酶，其對(duì)手性化合物2,4-二氯苯氧丙酸甲酯 (2,4-DPM) 的水解具有對(duì)映體選擇性，優(yōu)先催化水解S-2,4-DPM[17]。不同種類的作物中含有的酶系種類往往存在差異，可能會(huì)使手性農(nóng)藥在作物中表現(xiàn)出不同的選擇性結(jié)果，例如 (?)-戊唑醇在葡萄中降解快于 (+)-戊唑醇[18]，而 (+)-戊唑醇在草莓中降解快于 (?)-戊唑醇[19]，因此在多種作物中開(kāi)展選擇性降解研究同樣具有重要意義。目前關(guān)于丙溴磷對(duì)映體毒性研究主要集中于急性毒性[11]，而丙溴磷可在非靶標(biāo)生物的組織中富集[20]，在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)開(kāi)展丙溴磷對(duì)映體對(duì)于非靶標(biāo)生物的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)，從而為丙溴磷的全面風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。

3 結(jié)論

本研究建立了丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的殘留分析方法，利用所建立的方法測(cè)定了田間試驗(yàn)條件下丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的降解規(guī)律。結(jié)果顯示，丙溴磷對(duì)映體在柑橘中的降解具有選擇性，(+)-丙溴磷的降解速率快于 (?)-丙溴磷，從而導(dǎo)致(?)-丙溴磷的相對(duì)富集。研究結(jié)果可為手性農(nóng)藥對(duì)映體的環(huán)境行為研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。