柑橘類水果中氯蟲苯甲酰胺的檢測方法

王佳杰，朱亞瓊，唐文怡

品測（上海）檢測科技有限公司（上海 201108）

中國是世界上最早種植柑橘類水果的國家，距今已有4 000多年的歷史。氯蟲苯甲酰胺是一種新型殺蟲劑，其作用于魚尼丁受體（RyRs），通過破壞昆蟲細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca+環(huán)境的穩(wěn)定性，導(dǎo)致其肌肉調(diào)節(jié)衰弱、麻痹，直至害蟲死亡[1]，但過量使用會危害人體。我國頒布的GB 2763—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對植物源性食品和動物源性食品中氯蟲苯甲酰胺做出臨時限量要求，其范圍為在0.01～40 mg/kg之間[2]。但我國現(xiàn)有已實施的檢測標(biāo)準(zhǔn)中，僅有安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)DB34/T 2407—2015《大米中的氯蟲苯甲酰胺殘留量的測定 高效液相色譜法》。由于該檢測標(biāo)準(zhǔn)限定了基質(zhì)和地域，因此亟需制定涵蓋基質(zhì)種類全、檢測快速以及結(jié)果準(zhǔn)確的檢測標(biāo)準(zhǔn)為氯蟲苯甲酰胺的監(jiān)管提供技術(shù)支持。

氯蟲苯甲酰胺的特點(diǎn)為沸點(diǎn)較高故不易氣化，在有機(jī)溶劑中的溶解性較高，因而采用液相色譜儀或液相色譜-質(zhì)譜儀為主要檢測設(shè)備。近年來我國科研人員針對不同基質(zhì)中氯蟲苯甲酰胺的分析與檢測方法進(jìn)行研究與相關(guān)評述，如馬婧瑋等[3]、郝國輝等[4]、張云等[5]、賀敏等[6]分別研究了谷物和油料作物、西葫蘆、動物源性食品及玉米中氯蟲苯甲酰胺殘留的檢測方法。在這些研究中大多采用QuEChERS[7]與SPE[8]的凈化方式。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.84%，Dr.Ehrenstorfer公司）；氯化鈉（分析純，國藥）；乙腈、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、甲醇（色譜純，德國Merck試劑公司）；純化水（自制）；QuEChERS凈化管（15 mL，含900 mg MgSO4、150 mg GCB和150 mg PSA，上海安普科技股份有限公司）；SPE凈化柱（GCB/NH2柱，6 mL，含500 mg GCB和500 mg NH2，上海安普科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號I Class/TQ-S，配有ESI源和APCI源，美國Waters公司）；高效液相色譜儀（型號2695，配有紫外檢測器，美國Waters公司）；高速離心機(jī)（型號ROTINA 380R，法國Hettich公司）；電子天平（德國賽多利斯公司）；超聲機(jī)（型號SB25-12D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；氮吹儀（型號N-EVAP 112，美國Organomation公司）；渦旋振蕩器（德國IKA公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 檢測器的選擇

分別調(diào)整LC和LC-MS/MS的儀器參數(shù)以達(dá)到最佳響應(yīng)狀態(tài)，用較低質(zhì)量濃度（10 ng/mL，50 ng/mL）的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)，比較兩種檢測器的靈敏度（信噪比），優(yōu)先考慮同一濃度下信噪比大的作為后續(xù)試驗所用檢測器。

1.3.1.1 LC儀器條件

色譜柱，XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫，35 ℃；流動相，乙腈、水；洗脫方式，等度洗脫（50，50）；流速，0.8 mL/min；檢測波長，220 nm；進(jìn)樣體積，10 μL。

1.3.1.2 LC-MS/MS儀器條件

色譜柱，BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫，35 ℃；流動相，水（A）、乙腈（B）；洗脫方式，梯度洗脫（梯度洗脫見表1）；離子源，電噴霧離子源ESI+；毛細(xì)管電壓，3 000 V；去溶劑溫度，450 ℃；檢測方式，MRM（多離子監(jiān)測）；特征離子，484/285.7（定量離子）、484/452.7（定性離子）、484/177（定性離子）；進(jìn)樣體積，1 μL。

表1 梯度洗脫比例

1.3.2 校準(zhǔn)曲線的選擇

由于食品樣本基質(zhì)背景復(fù)雜，在前處理凈化后并不能完全去除雜質(zhì)的干擾，樣品共流出物的存在對目標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生很大影響，基質(zhì)效應(yīng)成為影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)鍵因素[9]。為防止在此類情況出現(xiàn)，試驗中加入了基質(zhì)曲線與溶劑配制的曲線進(jìn)行比較，觀察其斜率是否出現(xiàn)明顯變化。具體步驟：分別用甲醇和通過前處理得到的最終樣品提取液將氯蟲苯甲酰胺配制成質(zhì)量濃度為5，10，20，50和100 ng/mL的工作曲線上機(jī)檢測，將基質(zhì)溶液配制得到的曲線方程的斜率除以甲醇溶液配制得到的曲線方程的斜率，觀察比值的大小。

1.3.3 提取溶劑的選擇

由于氯蟲苯甲酰胺的分子結(jié)構(gòu)中含有C—N、C==O等極性共價鍵以及含氮雜環(huán)，極性較小，在水中溶解度很低（0.001 02 g/L），但在許多有機(jī)溶劑中具有一定的溶解度[10]。分別選用不同溶解度的乙腈、乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑。具體步驟：稱取3種樣品（橙子、柚子、檸檬），各10 g（精確至0.001g），置于50 mL離心管中，分別加入10 mL 3種提取溶劑和5 g氯化鈉，振蕩5 min后超聲10 min，以8 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液于40 ℃水浴氮吹近干，加入1 mL初始流動相溶解、定容，過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

1.3.4 凈化方式的選擇

試驗選用SPE和QuEChERS專門去除柑橘類水果中大量的天然色素、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。試驗步驟：稱取橙子、柚子、檸檬各10 g（精確至0.001 g）于50mL離心管中，加入10 mL提取溶劑和5 g氯化鈉，振蕩6 min后超聲8 min，以8 000 r/min 離心8 min，分別取上清液用QuEChERS方法和SPE方法凈化。

QuEChERS方法：取2 mL上清液至QuEChERS凈化管中，振搖5 min后以8 000 r/min 離心10 min，取出上清液，在40 ℃水浴氮?dú)獯抵两?，加? mL初始流動相溶解、定容，過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

SPE方法：將5 mL 上清液在40 ℃水浴氮吹近干，用2 mL二氯甲烷+甲醇（95：5，體積比）溶解殘渣，過GCB/NH2柱（先用6 mL二氯甲烷+甲醇（95：5，體積比）活化），再用5 mL二氯甲烷+甲醇（95：5，體積比）淋洗2次，收集全部洗脫液。洗脫液在40 ℃水浴氮?dú)獯抵两桑尤? mL初始流動相溶解、定容，過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇與曲線范圍和檢出限

分別用空白基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度10 ng/mL和50 ng/mL的氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，在LC和LC-MSMS上測試6次，得到的色譜圖/質(zhì)譜圖的信噪比和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表2。同一濃度下LC-MS/MS上的信噪比LC上的信噪比大兩個數(shù)量級且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，故LCMS/MS上的靈敏度和穩(wěn)健度好于LC，因此后續(xù)試驗均采用LC-MS/MS進(jìn)行檢測。由于LC-MS/MS在質(zhì)量濃度10 ng/mL下仍有較好的信噪比，因此，將此標(biāo)準(zhǔn)溶液再稀釋至質(zhì)量濃度5 ng/mL，上機(jī)檢測，圖譜見圖1。

表2 LC和LC-MS/MS不同濃度下信噪比

圖1 氯蟲苯甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖（質(zhì)量濃度：5 ng/mL）

由圖1可得，質(zhì)量濃度5 ng/mL時有較好的信噪比，考慮到后續(xù)前處理與基質(zhì)干擾的影響，故選此濃度為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度。同時，試驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度高于100 ng/mL時，氯蟲苯甲酰胺在LC-MS/MS上的響應(yīng)過載，導(dǎo)致線性相關(guān)性變差。最終確定5～100 ng/mL為最佳線性范圍，其相關(guān)系數(shù)大于0.99。重復(fù)進(jìn)20次空白基質(zhì)，計算其噪聲的標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb，按公式CL儀器=3Sb/b（b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率），得到儀器檢出限。將儀器檢出限乘以稀釋倍數(shù)，除以稱樣量，結(jié)合基質(zhì)干擾的影響確定方法檢出限為1 μg/kg。

2.2 校準(zhǔn)曲線的選擇結(jié)果

基質(zhì)效應(yīng)由基質(zhì)配制校準(zhǔn)曲線斜率比上純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率，斜率比越接近1，則視為基質(zhì)效應(yīng)越小。使用前處理得到的樣品提取液配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上機(jī)測試，得到的曲線方程、相關(guān)系數(shù)、斜率與斜率比見表3。

表3 不同溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及斜率、相關(guān)系數(shù)和斜率比

從表3中斜率比可以看出基質(zhì)效應(yīng)相當(dāng)明顯，但3種基質(zhì)之間的斜率比較為接近。由此得知，柑橘類水果中均含有某些物質(zhì)對氯蟲苯甲酰胺的離子化產(chǎn)生干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。故試驗選擇空白基質(zhì)提取液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為定量與定性的依據(jù)。

2.3 提取溶劑的選擇結(jié)果

試驗選擇3個濃度在不含氯蟲苯甲酰胺的橙子、柚子和檸檬中加標(biāo)，分別用乙腈、乙酸乙酯和丙酮提取，每個濃度做6次平行。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)丙酮溶解性較強(qiáng)，但雜質(zhì)相對較多，凈化的難度增加。與此同時丙酮與樣品中水分互溶，在加鹽的情況下未能與水完全分離，無法得到準(zhǔn)確結(jié)果，故不在表4中列出。乙腈和乙酸乙酯提取結(jié)果的具體數(shù)據(jù)見表4。

由表4可得，由乙酸乙酯提取的樣品的平均回收率明顯高于由乙腈提取的樣品，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也小。其原因可能為柑橘類水果中含有大量的有機(jī)酸和糖類等物質(zhì)，這些物質(zhì)經(jīng)乙腈提取，在濃縮時析出，最后溶解、定容時仍有少量肉眼可見的晶體狀物質(zhì)未能溶解，可能有部分目標(biāo)物質(zhì)包裹其中，導(dǎo)致回收率與精密度數(shù)據(jù)較差。

2.4 凈化方式的選擇結(jié)果

試驗選擇3個濃度在橙子、柚子和檸檬中加標(biāo)，用1.3.4的方法前處理。將測得的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表5。由SPE凈化的樣品相對標(biāo)準(zhǔn)偏差明顯小于由QuEChERS凈化的樣品，故后續(xù)試驗選擇SPE作為凈化方式。

表4 不同提取溶劑測得的氯蟲苯甲酰胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

表5 不同凈化方式測得的氯蟲苯甲酰胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 前處理方法的應(yīng)用

試驗結(jié)果表明：用乙酸乙酯提取，使用SPE方式凈化、LC-MS/MS檢測為柑橘類水果中氯蟲苯甲酰胺最為理想檢測方法。通過加標(biāo)方式對檢測方法進(jìn)行驗證，結(jié)果如表6所示。使用最佳前處理方法得到的回收率范圍在89.6%～105.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.8%，能夠滿足日常農(nóng)藥殘留檢測的需求。

表6 乙酸乙酯提取、SPE凈化測得的氯蟲苯甲酰胺的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

通過加標(biāo)試驗數(shù)據(jù)比對，建立了SPE凈化、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定柑橘類水果中氯蟲苯甲酰胺殘留的方法。該方法前處理快捷、準(zhǔn)確度和靈敏度高，同時彌補(bǔ)了國標(biāo)方法的不足，在氯蟲苯甲酰胺檢測方法的研究中起到的作用。