溶劑結(jié)晶法提取蕨菜葉芽中的植物甾醇

劉美琴，趙玉梅，龐惠文，喬建芬，張鑫

1. 山西鐵道職業(yè)技術(shù)學(xué)院（太原 030013）；2. 山西安泰集團(tuán)（介休 032000）

蕨菜又名如意菜、貓爪子菜、拳頭菜，營養(yǎng)成分豐富，粗蛋白和粗纖維含量較高，素有“山菜之王”的美譽(yù)，廣泛分布于我國海拔500～1 700 m區(qū)間的地區(qū)[1-2]。蕨菜富含18種氨基酸，其中10種為人體必需氨基酸[3]。蕨菜的幼嫩葉芽中含有豐富天然甾體類物質(zhì)，如β-谷固醇、豆甾烯-3, 6-二酮、那坡甾酮A等[4]，兼具食用價值和藥用價值。植物類甾醇具有降低人體膽固醇和預(yù)防心腦血管疾病的功效[5]，被國際營養(yǎng)學(xué)會推薦為人類未來十大功能性營養(yǎng)成分之一，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域，其中尤為重要的是在臨床醫(yī)學(xué)中，將植物甾醇代替膽固醇應(yīng)用于藥物脂質(zhì)體制備[6-7]。植物類甾醇對皮膚有很高的滲透性，能保持皮膚水分，促進(jìn)新陳代謝，抑制皮膚炎癥，可作為W/O乳化劑用于化妝品配方生產(chǎn)。試驗(yàn)以山西產(chǎn)蕨菜為原料，采用溶劑提取-結(jié)晶法提取甾醇類物質(zhì)，并對影響甾醇提取量和品質(zhì)的因素進(jìn)行了研究。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)中的材料、試劑和儀器

蕨菜，東港市惠源食品有限公司；乙酸乙酯，河南西伯化工產(chǎn)品有限公司；正己烷，常州市中超化工有限公司；乙醇，濟(jì)南創(chuàng)世化工有限公司。

SHZ-D實(shí)驗(yàn)室抽濾機(jī)，濟(jì)寧程煤工礦設(shè)備有限公司；DZF-621013真空干燥箱，江蘇安盈環(huán)境設(shè)備有限公司；LWL臥式高速離心機(jī)，張家港市越豐化工機(jī)械有限公司；HWFT低溫恒溫箱，蘇州菲唐檢測設(shè)備有限公司；GC-MS3100型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，廈門和頌電子科技有限公司；DSRII動態(tài)剪切流變儀，上海勞瑞儀器設(shè)備有限公司；DR-A1數(shù)顯阿貝折光儀，泉州天美化工儀器有限公司；DSC7020差示掃描量熱儀，上海熱冰電子科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法[8-9]

摘取新鮮蕨菜的嫩綠葉芽，剪碎并粗研磨后倒入足量的乙酸乙酯溶液中，充分浸提6 h后抽濾除去濾渣得到黃綠色濾液。真空濃縮黃綠色濾液得到初步提取的粗提取液。粗提取液高速離心后立即分離出上清液，加入適量的正己烷促進(jìn)甾醇結(jié)晶，結(jié)晶時間6 h。濾去溶劑后烘干結(jié)晶產(chǎn)物至恒重，再加入足量熱乙醇溶液后進(jìn)行兩次重結(jié)晶操作，此時得到的結(jié)晶物為純度較高的植物甾醇混合物。將結(jié)晶物加入少量的乙酸乙酯溶劑，冷藏于冰柜中備用。

1.3 試驗(yàn)中的相關(guān)測定

GC-MS試驗(yàn)條件：進(jìn)樣量1.0 μL，氮?dú)廨d氣流速2.0 mL/min，色譜柱HP-10MS（10%甲基聚硅氧烷+90%二甲基苯；25 m×0.5 m mid，0.25 μm薄膜），進(jìn)樣口溫度220 ℃，柱溫起始溫度100 ℃，以10 ℃/min速率升溫到280 ℃；DSC分析：采用DSC7020差示掃描量熱儀測定甾醇的吸熱曲線，掃描溫度范圍20～250℃，升溫速率5 ℃/min，氮?dú)饬髁?0 mL/min；表觀黏度的測定[10]：采用動態(tài)流變儀測定甾醇表觀黏度，樣品0.1 g，錐板夾具直徑50 mm，錐角2°5’±2’，剪切率從0.1 s-1到100 s-1。

甾醇含量的測定[11]：用無水乙醇溶解0.1 g結(jié)晶樣品并定容至25 mL容量瓶。取出5.0 mL溶液后加入2.0 mL磷硫鐵顯色劑，混勻后靜置30 min，在525 nm波長處測其吸光度來計算甾醇含量，如式（1）所示。

式中：m為樣品所測吸光度所對應(yīng)的甾醇量，μg/mL；V為定容體積，mL；B為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，μg。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析

提取液的GC-MS分析圖譜如圖1所示。主要出峰時間集中在18～28 min之間。按照出峰順序，9個出峰位置依次分別為豆甾烯-3, 6-二酮、1-二十八烷醇、1-二十一烷醇、1-二十二碳烯、β-谷甾醇、豆甾醇、草油甾醇、牛膝甾酮、那坡甾酮A。以檢出峰總面積為100%來計，β-谷甾醇含量最大（46.18%），其次為豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%）?？梢悦黠@地看出植物甾醇總含量超過85%，說明試驗(yàn)提取方案切實(shí)可行，試驗(yàn)效果良好。

圖1 提取液的GC-MS分析圖譜

2.2 DSC分析

DSC圖譜中的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度與聚合物的基本性能有著緊密的聯(lián)系。試驗(yàn)提取的甾醇的DSC曲線如圖2所示。結(jié)果顯示甾醇有兩個玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（軟段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和硬段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度）。甾醇混合物中分子的軟硬段結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的微相分離。軟段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為78.86 ℃，硬段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為237.15 ℃，在溫度低于200 ℃的情況下硬段結(jié)構(gòu)的分子運(yùn)動范圍有限，與軟段結(jié)構(gòu)分子之間的接觸混合概率較小，從而實(shí)現(xiàn)軟硬段分子的微相分離，表觀上表現(xiàn)為兩種玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相差較大。

圖2 甾醇的DSC分析圖譜

2.3 不同料液質(zhì)量比對植物甾醇提取量的影響

不同的原料與乙酸乙酯質(zhì)量比（料液質(zhì)量比）對蕨菜中甾醇類物質(zhì)的提取量柱形圖如圖3所示。固定其他提取條件不變，料液質(zhì)量比分別為1：1，1：3，1：5，1：7和1：10，測定甾醇提取量。甾醇類物質(zhì)的提取量隨著乙酸乙酯用量的增大而顯著升高，當(dāng)料液質(zhì)量比達(dá)到1：7時，甾醇提取量達(dá)到最大（97 mg/g）；之后增大乙酸乙酯用量，提取效果不甚理想。根據(jù)傳質(zhì)規(guī)律，若提取溶劑達(dá)到一定量時，提取帶來的正面效果不及甾醇濃度被溶劑稀釋所帶來的負(fù)面效應(yīng)，因而料液質(zhì)量比達(dá)到1：10時，甾醇提取量反而略有下降。因此，植物甾醇類物質(zhì)被提取的料液質(zhì)量比最佳為1：7。

圖3 不同料液質(zhì)量比條件下對應(yīng)的甾醇提取量

2.4 結(jié)晶過程對甾醇混合物的影響

2.4.1 結(jié)晶溫度對植物甾醇總含量的影響

考察不同結(jié)晶溫度（-20，-15，-10，-5，0和5℃）對甾醇混合物含量的影響，從而確定試驗(yàn)中的最佳結(jié)晶溫度。由圖4可知，在低溫條件下正己烷易與甾醇混合物共同結(jié)晶析出，使甾醇總含量較低。而當(dāng)結(jié)晶溫度超過0 ℃時，結(jié)晶效果不明顯，試驗(yàn)效果不理想。綜合來講，結(jié)晶溫度應(yīng)控制在（-10±2）℃范圍內(nèi)為宜。

2.4.2 結(jié)晶時間對植物甾醇總含量的影響

考察不同結(jié)晶時間（2，4，6，8，10和12 h）對甾醇混合物含量的影響，固定其他試驗(yàn)條件不變，優(yōu)選試驗(yàn)中的最佳結(jié)晶時間。如圖5所示，結(jié)晶時間越長，甾醇混合物從溶劑中脫離后結(jié)晶的可能性越大，純度越高，考慮到試驗(yàn)效率和結(jié)晶時間過長導(dǎo)致甾醇活性下降，結(jié)晶時間選擇6 h。

圖4 結(jié)晶溫度對甾醇總含量的影響關(guān)系曲線

圖5 結(jié)晶時間對甾醇總含量的影響關(guān)系曲線

2.4.3 重結(jié)晶對植物甾醇總量的影響

試驗(yàn)考察重結(jié)晶次數(shù)對于最終植物甾醇提取質(zhì)量的影響關(guān)系，結(jié)果如表1所示。隨著重結(jié)晶次數(shù)的增加，甾醇的純度固然可以隨重結(jié)晶次數(shù)的增大而提升，但同時實(shí)驗(yàn)操作的頻繁性會使得甾醇提取物的流失量隨之增加，使得提取總量下降。植物甾醇純度達(dá)到90%即可滿足試驗(yàn)需求，故確定試驗(yàn)重結(jié)晶次數(shù)為2次。

表1 重結(jié)晶次數(shù)對植物甾醇總量的影響變化

2.5 植物甾醇混合物在加熱過程中的表觀黏度和折光系數(shù)

表觀黏度與甾醇的濃度呈正相關(guān)聯(lián)系，而折光系數(shù)在一些情況下也會與表觀黏度的變化趨勢相同。試驗(yàn)提取的植物類甾醇混合物在加熱溫度分別為120和180 ℃條件下的表觀黏度和折光系數(shù)變化值如表2所示。當(dāng)加熱溫度為120 ℃時，表觀黏度與折光系數(shù)均在一個較小的范圍內(nèi)波動，沒有很直觀的變化趨勢，整體而言表觀黏度和折光系數(shù)隨加熱時間的延長而小幅增大。但當(dāng)加熱溫度為180 ℃時，甾醇分子之間可能發(fā)生聚合反應(yīng)，形成C—C、C—O—C等連接結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，同時一些甾酮結(jié)構(gòu)的小分子由于熱穩(wěn)定性較差，會發(fā)生結(jié)構(gòu)異變或分解成單元結(jié)構(gòu)更小的分子，整個甾醇混合物的分子結(jié)構(gòu)與原先發(fā)生了較大變化，表現(xiàn)在表觀黏度和折光系數(shù)上，可以明顯地觀察到二者隨著加熱時間的延長而顯著增大。

表2 植物甾醇混合物的表觀黏度和折光系數(shù)變化

3 結(jié)論

以摘取蕨菜嫩綠葉芽為原料，采用溶劑提取-結(jié)晶-重結(jié)晶的工藝流程提取其中的甾醇類物質(zhì)。GC-MS分析結(jié)果顯示，提取物主要組成成分為β-谷甾醇（46.18%）、豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%），植物甾醇總含量超過85%。DSC的分析則表現(xiàn)出軟硬段分子的微相分離，形成軟段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（78.86 ℃）和硬段玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（237.15℃）的兩個吸熱峰。料液質(zhì)量比、結(jié)晶溫度和結(jié)晶時間會對提取的植物甾醇總含量產(chǎn)生顯著影響，經(jīng)分析探討確定，當(dāng)料液質(zhì)量比為1：7，結(jié)晶溫度控制在（-10±2）℃，結(jié)晶時間為6 h時試驗(yàn)效果最佳。重結(jié)晶次數(shù)會對甾醇提取總量產(chǎn)生明顯影響，考慮到實(shí)驗(yàn)頻繁性會減少甾醇提取物的質(zhì)量，純度達(dá)到90%即可滿足需求，確定重結(jié)晶次數(shù)為2次。試驗(yàn)還研究了在加熱過程中甾醇提取物的表觀黏度和折光系數(shù)所產(chǎn)生的變化，當(dāng)加熱溫度為120 ℃時，2種性能參數(shù)在一個較小范圍內(nèi)波動；當(dāng)加熱溫度為180℃時，甾醇提取物的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，表現(xiàn)在表觀黏度和折光系數(shù)上，二者隨著加熱時間的延長而明顯增大。綜上所述，提取蕨菜中甾醇的試驗(yàn)方法切實(shí)可行，提取物的純度和質(zhì)量均能達(dá)到使用需求，提取物的熱穩(wěn)定性良好，試驗(yàn)效果較為理想。