響應曲面法優(yōu)化聯(lián)合提取結(jié)球紅菊苣中菊苣酸和香豆素

王一婷，朱建星*，劉佳欣，賀夢瑤，張萬忠

沈陽化工大學制藥與生物工程學院（沈陽 110142）

結(jié)球紅菊苣（Cichoricum intybusL. var.foliosumHegi.）是野生菊苣（Cichorium intybusL.）的變種，又名紅菊苣、白菊苣等，為菊科菊苣屬多年生草本植物[1-2]。菊苣中主要含有菊苣酸等多種活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)菊苣粗提物具有清肝利膽、降血脂、降血糖、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[3]，菊苣中含有的菊苣酸、香豆素含量較為豐富且極性相近，但關(guān)于結(jié)球紅菊苣中的菊苣酸、香豆素聯(lián)合提取的研究報道比較少見[4]。作為一種高效綠色提取技術(shù)，復合酶解法提取效率高，不容易引入其他的雜質(zhì)，而且不影響組織結(jié)構(gòu)及目標物質(zhì)的生物活性，成為當前研究熱點[5]。以乙醇溶液為酶解反應溶劑，采用纖維素酶和果膠酶處理菊苣粉末的酶解工藝，對結(jié)球紅菊苣中菊苣酸、香豆素進行聯(lián)合提取，為結(jié)球紅菊苣活性成分提取工藝的綜合應用和菊苣的功能性食品開發(fā)及大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)[6-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

結(jié)球紅菊苣（市場購買）；無水乙醇（分析純，天津市博迪化工股份有限公司）；纖維素酶（＞15 000 U/g，國藥集團化學試劑有限公司）；果膠酶（＞15 000 U/g，國藥集團化學試劑有限公司）；菊苣酸對照品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；秦皮乙素對照品（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；高效液相色譜（安捷倫1200）；全自動酶標儀（Synergy HTX美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理

取適量的結(jié)球菊苣，用吹風除塵后，干燥后磨粉過孔徑0.425 mm篩，真空干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 標準曲線的建立及結(jié)球菊苣菊苣酸、香豆素含量測定

菊苣酸標準曲線的建立：準確稱取菊苣酸標準品配制質(zhì)量濃度為2.00，3.33，5.00，6.25，8.33，10.00，12.50，16.67和25.00 μg/mL的標準溶液。以無水乙醇為空白對照，用酶標儀在326 nm波長下測定吸光度，以菊苣酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為Y=0.045 6x-0.049 8（R2=0.999 7）。通過樣品提取液測得的吸光度，在標準曲線范圍內(nèi)對應出相應菊苣酸含量，計算出對應的1 g紅菊苣粉中的菊苣酸得率。菊苣酸提取得率的計算如式（1）。

式中：m為所測定溶液的菊苣酸質(zhì)量，μg；V1為所取待測液體積；V為提取稀釋液總體積；M為樣品質(zhì)量，g。

香豆素標準曲線的建立：準確稱取秦皮乙素標準品配制質(zhì)量濃度為1.76，5.28，10.56，14.08，17.6，21.12和26.4 μg/mL的標準溶液。以無水乙醇為空白對照，用酶標儀在345 nm波長下測定吸光度，以香豆素濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為Y=0.049 5x-0.011 8（R2=0.999 6）。通過樣品提取液測得的吸光度，在標準曲線范圍內(nèi)對應出相應香豆素的含量，計算出對應的1 g紅菊苣粉中的香豆素得率。香豆素提取得率的計算如式（2）。

式中：m為所測定溶液的香豆素質(zhì)量，μg；V1為所取待測液體積；V為提取稀釋液總體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 酶解過程單因素試驗

1.2.3.1 乙醇質(zhì)量分數(shù)對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL），分別加入質(zhì)量分數(shù)0，20%，40%，55%，60%，65%，70%和75%的乙醇。于55 ℃振蕩，40 min。水浴85 ℃滅酶，將反應液抽濾。取濾液稀釋100倍，用酶標儀測定菊苣酸、香豆素含量，計算提取得率。

1.2.3.2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶分別為0，0.5+0.1，1+0.2，2+0.4和3+0.6 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入質(zhì)量分數(shù)65%乙醇，55℃振蕩40 min。后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 提取時間對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，以料液比1︰25（g/mL）加入質(zhì)量分數(shù)65%乙醇。于55 ℃振蕩20，30，40，50和60 min。后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 提取溫度對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

稱取1 g菊苣粉末5份，加入1 mL纖維素酶+果膠酶為2+0.4 mg的酶液，分別加入料液比1︰25（g/mL）的65%乙醇。分別在40，45，50，55和60 ℃，振蕩40 min，后續(xù)操作同1.2.3.1。

1.2.4 響應面設計

為優(yōu)化提取工藝設計，根據(jù)單因素試驗對乙醇質(zhì)量分數(shù)（A）、加酶量（纖維素酶+果膠酶）（B）、提取時間（C）、提取溫度（D）確定最佳條件，設計四因素三水平響應面分析，分別用-1、0和1代表不同水平，以菊苣酸、香豆素提取得率作為響應值，采用Box-Behnken設計并建立數(shù)學模型。各試驗因素與水平的設計如表1所示。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗中每個處理重復3次，采用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

表1 響應面因素設計水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 提取菊苣酸、香豆素的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇質(zhì)量分數(shù)對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

乙醇質(zhì)量分數(shù)對菊苣酸、香豆素提取得率的影響見圖1。與不加乙醇的水體系（乙醇質(zhì)量分數(shù)0%）相比，在乙醇溶液體系中的纖維素酶和果膠酶有更大的酶促水解效率，酶對細胞壁的水解和乙醇溶液對菊苣總苷類物質(zhì)的浸出產(chǎn)生協(xié)同效應[3]。使用水體系時，菊苣酸、香豆素提取得率均較低，而采用乙醇溶液水解體系可獲得更高的提取得率。隨著乙醇質(zhì)量分數(shù)增大，菊苣酸、香豆素的提取得率也在增大，乙醇質(zhì)量分數(shù)65%時，提取得率最大，乙醇質(zhì)量分數(shù)大于65%時，提取得率下降，所以確定最優(yōu)乙醇質(zhì)量分數(shù)為65%，此條件下的提取得率比水體系中的提取得率高38%以上。

2.1.2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

加酶量對菊苣酸、香豆素提取得率的影響見圖2。與不加酶相比，添加復合酶制劑明顯提高菊苣酸和香豆素提取得率，分別提高36%和31.7%。提取得率隨加酶量增大而逐漸增大，每克菊苣粉末加入2.0mg纖維素酶、0.4 mg果膠酶時，菊苣酸和香豆素的提取得率最大，但繼續(xù)增加酶用量，反而導致提取得率出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為較多的酶黏附于菊苣細胞壁上，不利于菊苣酸、香豆素類化合物向溶劑中擴散。

圖1 乙醇質(zhì)量分數(shù)對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

圖2 加酶量（纖維素酶+果膠酶）對菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

2.1.3 提取時間對菊苣酸、香豆素提取得率的影響

提取時間對菊苣酸、香豆素提取得率的影響見圖3。隨著提取時間增長，菊苣酸、香豆素提取得率增大，40 min時提取得率達到最大，提取時間40 min后提取得率便下降，這是因為提取時間會直接影響有效成分的浸出，提取時間過短有效成分還沒有充分反應，時間過長可能會導致有效成分降解，所以確定最優(yōu)提取時間為40 min。

圖3 提取時間對菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

2.1.4 提取溫度對菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

提取溫度對菊苣酸、香豆素提取工藝的影響見圖4。隨著提取溫度增大提取得率不斷升高，在50 ℃時達到最高，55 ℃以上提取得率有所下降，這是因為溫度會增強細胞的透性，有利于內(nèi)容物的有效浸出，但溫度過高時會使菊苣酸、香豆素分解導致其提取得率下降，所以確定最優(yōu)提取溫度為50 ℃。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗設計結(jié)果分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件（表2）進行回歸擬合得到菊苣酸（Y1）、香豆素提取率（Y2）與提取因素乙醇質(zhì)量分數(shù)（A）、酶量（B）、時間（C）、溫度（D）之間的二次多元回歸方程為Y1=3.41-0.018A+0.030B+0.063C+0.024D+0.008 5AB+0.17AC-0.042AD-0.028BC-0.14BD+0.097CD-0.65A2-0.40B2-0.36C2-0.11D2；Y2=2.38-0.001 917A+0.041B+0.049C+0.009 833D+0.019AB+0.12AC-0.016AD+0.016BC-0.12BD+0.066CD-0.62A2-0.30B2-0.26C2-0.11D2。

圖4 提取溫度對菊苣酸、香豆素提取工藝的影響

表2 響應曲面法試驗設計及結(jié)果

由表3所示的方差分析數(shù)據(jù)可知，模型F=37.3，p＜0.000 1，表明模型對提取工藝達到極顯著，CV=3.11%，R2adj=0.947 8，R2=0.973 9，證明模型擬合度良好，試驗誤差小，可以應用于響應曲面法優(yōu)化提取結(jié)球菊苣菊苣酸。根據(jù)各因素的顯著性檢驗p值的大小可以看出，各因素對菊苣酸提取工藝的影響大小為提取時間＞加酶量（纖維素酶+果膠酶）＞提取溫度＞乙醇質(zhì)量分數(shù)。

表3 菊苣酸提取率回歸方程方差分析表

由表4所示的方差分析數(shù)據(jù)可知，模型F=52.88，p＜0.000 1，CV=3.45%，R2adj=0.962 9，R2=0.981 4，證明模型的擬合度良好，試驗誤差小，可應用于響應曲面法優(yōu)化的提取結(jié)球菊苣香豆素。根據(jù)各因素的顯著性檢驗p值的大小可以看出，各因素對香豆素提取工藝的影響大小為提取時間＞加酶量（纖維素酶+果膠酶）＞提取溫度＞乙醇質(zhì)量分數(shù)。

表4 香豆素提取率回歸方程方差分析表

2.2.2 響應曲面圖分析

響應曲面圖可以更直觀的反映各因素交互作用對響應值的影響。將A、B、C、D中任意2個因素與菊苣酸提取得率合為三維曲面圖，分析比較圖5的兩兩交互作用可知乙醇質(zhì)量分數(shù)和時間、酶量和溫度、時間和溫度交互作用影響較大。

圖5 各因素交互作用對菊苣酸得率影響的響應面圖

圖6 各因素交互作用對香豆素得率影響的響應面圖

將A、B、C、D中任意2個因素與香豆素提取得率合為三維曲面圖，分析比較圖6的兩兩交互作用可知，乙醇質(zhì)量分數(shù)和時間、酶量和溫度、時間和溫度交互作用影響較大。

2.2.3 驗證試驗

響應面設計優(yōu)化提取工藝結(jié)球紅菊苣各因素的最優(yōu)值為乙醇質(zhì)量分數(shù)65.04%，每克菊苣粉末加酶量（纖維素酶+果膠酶）2.04+0.408 mg、提取時間42.06min、提取溫度55.91 ℃。為方便試驗操作將條件修正為乙醇質(zhì)量分數(shù)65%，加酶量（纖維素酶+果膠酶）2+0.4 mg，時間42 min，溫度56 ℃。在此條件下進行3次重復驗證試驗，菊苣酸提取得率為3.471%，3.467%和3.472%，平均提取得率為3.47%，香豆素提取得率為2.437%，2.441%和2.445%，平均提取得率為2.44%，與理論值基本吻合。

3 結(jié)論

試驗以結(jié)球紅菊苣為原料采用復合酶（纖維素酶+果膠酶）聯(lián)合水解提取菊苣酸、香豆素，并通過設計響應曲面法進行試驗分析及優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝條件為乙醇質(zhì)量分數(shù)65%、每克菊苣粉末加酶量（纖維素酶+果膠酶）2 mg+0.4 mg、提取時間42 min、提取溫度56 ℃，菊苣酸提取得率為3.47%，香豆素提取得率為2.44%，與模型預測的提取得率相差誤差較小，模型與實際結(jié)果相吻合。因此，利用設計響應曲面法優(yōu)化對結(jié)球菊苣菊苣酸、香豆素提取的聯(lián)合提取工藝是科學可行的，與不加酶的提取工藝相比，采用乙醇溶液體系添加復合酶制劑的提取工藝明顯提高菊苣酸和香豆素的提取得率，分別提高36%和31.7%，且更快速和環(huán)保。