酶解豆清液制備抗氧化肽

尹樂(lè)斌 *，劉丹，廖聰，楊愛(ài)蓮，何平

1. 邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院（邵陽(yáng) 422000）；2. 邵陽(yáng)學(xué)院豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（邵陽(yáng) 422000）

豆清液是豆制品生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物，每加工處理1 t大豆將產(chǎn)生2～5 t豆清液，且豆清液富含氨基酸、異黃酮以及低聚糖等營(yíng)養(yǎng)成分。大豆多肽是大豆蛋白的水解產(chǎn)物，具有降血壓、抗氧化、抗疲勞等[1-4]優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有良好的發(fā)展前景[5]，且與大豆蛋白相比，大豆多肽的相對(duì)分子量較小，更容易被吸收利用。利用豆清液作為多肽產(chǎn)品的原材料可以減少豆清液的浪費(fèi)，同時(shí)也能為企業(yè)增添經(jīng)濟(jì)效益。

抗氧化肽是指具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)，在維持機(jī)體自由基平衡，提高機(jī)體抗衰老能力與抵抗疾病等方面具有重要的作用[6]，利用酶水解蛋白質(zhì)可獲得具有良好抗氧化活性的多肽，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一[7-9]。胃蛋白酶是專一性較強(qiáng)的蛋白酶，具有一定的氨基酸序列選擇特異性，優(yōu)先斷裂由芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）或亮氨酸形成的肽鍵[10]。有研究表明胃蛋白酶水解蛋白（如米糠蛋白、苦蕎球蛋白、芝麻蛋白等）可獲得具有抗氧化性的水解物[11-14]；Zhang等[15-16]利用堿性蛋白酶酶解得到大豆水解液對(duì)DPPH自由基具有較高的清除率，利用所得抗氧化肽評(píng)估合成肽對(duì)氧化的細(xì)胞保護(hù)作用人腸道Caco-2細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。但胃蛋白酶水解豆清液制備豆清多肽及其對(duì)抗氧化活性研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)對(duì)胃蛋白酶水解豆清液生產(chǎn)多肽的探索研究，旨在為豆清液的再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

722型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；VELOCITY 14R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Dynamica Scientific Ltd.）；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

豆清液（學(xué)校果蔬清潔加工實(shí)驗(yàn)室提供）；胃蛋白酶（河北格貝達(dá)生物科技有限公司）；2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，上海如吉生物科技發(fā)展公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Shanghai Chemical Industy Park）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解液的制備

稱取一定量的豆清液，調(diào)節(jié)pH，加入胃蛋白酶酶解數(shù)小時(shí)。酶解結(jié)束后取出，于沸水中滅酶10 min，室溫冷卻，在4 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液進(jìn)行測(cè)定。此上清液即為多肽上清液。

1.2.2 多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定

多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]并稍作改動(dòng)。將豆清液和豆清原液與10%三氯乙酸（TCA）溶液以體積比1︰1加入至2 mL離心管中，靜置10 min，在7 000 r/min下離心15 min。取1 mL上清液加水稀釋至6 mL，加入4 mL雙縮脲溶液，搖勻，靜置30 min后，在540 nm處測(cè)定吸光度，用牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線算出多肽質(zhì)量濃度。按式（1）計(jì)算多肽產(chǎn)率。

式中：D為多肽產(chǎn)率，%；h1為酶解后多肽質(zhì)量濃度，mg/mL；h2為酶解前多肽質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.3 抗氧化活性測(cè)定

將在最佳工藝條件酶解過(guò)的豆清液用真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h至固體狀的豆清多肽樣品和VC稀釋成不同濃度待測(cè)液。ABTS自由基清除率測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]的方法；DPPH自由基清除率測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]的方法。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

測(cè)定胃蛋白酶在不同條件下，即酶解時(shí)間（4，5，6，7和8 h）、酶與底物濃度比（0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 g/mL）、初始pH（4.5，4.0，3.5，3.0，2.5和2.0）和酶解溫度（27，32，37，42，47和52 ℃）對(duì)水解豆清液的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，以多肽產(chǎn)率為指標(biāo)應(yīng)用響應(yīng)面分析法中Box-Behnken的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化出最佳工藝參數(shù)。

表1 胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽的響應(yīng)面試驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多肽產(chǎn)率先逐漸加大到達(dá)峰值再逐漸減小，曲線整體呈現(xiàn)開(kāi)口向下拋物線趨勢(shì)。出現(xiàn)這種趨勢(shì)可能是因?yàn)殡S著水解的進(jìn)行，底物濃度下降，多肽質(zhì)量濃度增加，多肽與蛋白質(zhì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。而酶活力可能隨著溫度或體系pH改變而降低，出現(xiàn)水解剩余底物能力減弱，或者不具有水解能力[20]。在整個(gè)時(shí)間段內(nèi)，多肽產(chǎn)率最大為64.85%，出現(xiàn)在第6小時(shí)和第7小時(shí)；最小多肽產(chǎn)率為50.63%，出現(xiàn)在第8小時(shí)（見(jiàn)圖1）。選用胃蛋白酶水解豆清液的時(shí)間為5，6和7 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

2.1.2 酶與底物濃度比對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

酶與底物濃度比對(duì)多肽產(chǎn)率的影響如圖2所示。隨著濃度比增長(zhǎng)，多肽產(chǎn)率先逐漸加大到達(dá)峰值再逐漸減小，曲線整體呈現(xiàn)開(kāi)口向下拋物線趨勢(shì)。曲線預(yù)期趨勢(shì)是先上升后趨于平緩，呈現(xiàn)拋物線的原因可能是隨著酶與底物濃度比增多，酶之間出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制或酶自身相互水解，導(dǎo)致酶活力降低。在5個(gè)濃度梯度中，多肽產(chǎn)率最大為32.14%，出現(xiàn)在0.7 g/mL；最小多肽產(chǎn)率為25.2%，出現(xiàn)在0.9 g/mL。選用胃蛋白酶水解豆清液的酶與底物濃度比0.6，0.7和0.8 g/mL進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖2 酶與底物濃度比對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

2.1.3 pH對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

隨著pH增長(zhǎng)，多肽產(chǎn)率先逐漸加大到達(dá)峰值再逐漸減小，曲線整體呈現(xiàn)開(kāi)口向下拋物線趨勢(shì)，這是因?yàn)槲傅鞍酌甘且环N酸性酶且有最適pH，在酸性條件下有較高活性并在最佳酸性條件下活性最高（見(jiàn)圖3）。酶解底物的帶電狀態(tài)會(huì)因pH變化而改變。底物是蛋白質(zhì)、肽或氨基酸等兩性電解質(zhì)時(shí)，隨著pH改變底物呈現(xiàn)不同解離狀態(tài)，酶的活力部位往往只能作用于底物的一種解離狀態(tài)，且酶分子的帶電狀態(tài)也會(huì)隨著pH發(fā)生變化[20]。6個(gè)pH梯度中，多肽產(chǎn)率最大為14.54%，出現(xiàn)在pH 4.00；最小多肽產(chǎn)率為8.39%，出現(xiàn)在pH 2.0。選用初始pH 3.5，4.0和4.5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.4 溫度對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

隨著溫度的增長(zhǎng)，多肽產(chǎn)率先逐漸加大到達(dá)峰值再逐漸減小，曲線整體呈現(xiàn)開(kāi)口向下拋物線趨勢(shì)，蛋白酶作為一種蛋白質(zhì)類生物催化劑，受溫度影響較大，在一定溫度范圍內(nèi)，催化反應(yīng)的速率隨著溫度上升而上升，但是超過(guò)一定溫度催化活性反而降低。6個(gè)溫度梯度中，多肽產(chǎn)率最大為79.44%，出現(xiàn)在溫度32 ℃；最小多肽產(chǎn)率為62.47%，出現(xiàn)在52 ℃（見(jiàn)圖4）。選用酶解溫度27，32和37 ℃進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 pH對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

圖4 溫度對(duì)胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果（表2）

2.2.2 模型建立及顯著性分析

利用軟件Design-Expert Version 8.0.6.1可以得到回歸方程和方差分析表格，見(jiàn)表3。

從表3看到，該多肽產(chǎn)率模型（模型項(xiàng)F值有0.38%的可能是由于干擾）回歸高度顯著（0.000 1≤p＜0.01），失擬項(xiàng)F值（有21.90%的可能性是由于干擾）為2.30意味著相對(duì)于純誤差而言，失擬項(xiàng)并不顯著，且R2=0.819 8，R2adj=0.639 6，因此可以用來(lái)預(yù)測(cè)胃蛋白酶水解豆清液生產(chǎn)大豆多肽的工藝。各個(gè)因素影響的大小順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈖H＞酶與底物濃度比＞酶解時(shí)間。D2項(xiàng)p＜0.000 1說(shuō)明D2項(xiàng)偏回歸系數(shù)差異極顯著。

表2 胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3 胃蛋白酶酶解產(chǎn)豆清多肽產(chǎn)率方差分析

2.2.3 最佳工藝條件的確定

使用Design-Expert Version 8.0.6.1軟件，得出胃蛋白酶水解豆清液生產(chǎn)大豆多肽的最佳工藝條件為酶解時(shí)間7 h、酶與底物濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31.33 ℃。使用該工藝條件，預(yù)期大豆多肽產(chǎn)率為39.13%?？紤]實(shí)際操作，選擇酶解時(shí)間7 h、酶與底物濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31℃。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得大豆多肽產(chǎn)率為40.08%，與預(yù)測(cè)值相比無(wú)顯著差異，說(shuō)明通過(guò)Design-Expert Version 8.0.6.1軟件分析得到的最佳工藝條件可行。

2.3 抗氧化活性研究試驗(yàn)

2.3.1 ABTS自由基清除率測(cè)定

豆清液酶解物對(duì)ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化試驗(yàn)所測(cè)定范圍內(nèi)，豆清液酶解物和VC對(duì)ABTS自由基清除率均隨自身濃度增大而增強(qiáng)，且VC溶液在0.016 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到最大100%，豆清液酶解物在0～0.05 g/mL的濃度范圍內(nèi)，對(duì)ABTS自由基清除率最大達(dá)到100%（見(jiàn)圖5）。

圖5 VC和豆清酶解物對(duì)ABTS自由基清除率的影響

2.3.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

豆清酶解物對(duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，但豆清液酶解物清除能力要弱于VC。在抗氧化試驗(yàn)所測(cè)定范圍內(nèi)，豆清酶解物和VC對(duì)DPPH自由基清除率均隨自身濃度增大而增強(qiáng)，且VC 0.032 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到最大95.6%，豆清酶解物0.05 g/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到最大98.8%（見(jiàn)圖6）。在試驗(yàn)測(cè)定的范圍外，即VC質(zhì)量濃度大于0.032 mg/mL和豆清酶解物濃度大于0.05 g/mL，2種樣品對(duì)DPPH自由基清除率會(huì)繼續(xù)增大并最終達(dá)到100%。

圖6 VC和豆清酶解物對(duì)DPPH自由基清除率的影響

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken原理，利用Design-Export Version 8.0.6.1軟件建立以豆清多肽產(chǎn)率為指標(biāo)的二次多項(xiàng)式回歸模型，用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶酶解制備豆清多肽的工藝。結(jié)果表明，最優(yōu)工藝條件為酶解最優(yōu)條件為時(shí)間7 h，酶與豆清液濃度比0.8 g/mL、初始pH 3.5、酶解溫度31 ℃，在此條件下多肽產(chǎn)率為40.08%；抗氧化試驗(yàn)中，豆清多肽對(duì)ABTS自由基的清除率最大可達(dá)100%，對(duì)DPPH自由基的清除率最大可達(dá)98.8%。結(jié)果表明胃蛋白酶酶解豆清液制備的豆清多肽具有較好的抗氧化性，可作為優(yōu)質(zhì)抗氧化肽的良好來(lái)源，還需深入探究豆清多肽的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。胃蛋白酶酶解可有效提高豆清多肽產(chǎn)率，可為豆清多肽的制備和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)，有利于豆清液的再利用。