水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的影響

楊昭，黃佳佳，姚玉靜*，曾琳琦，凌葉婷

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院食品學(xué)院（廣州 510520）

牡蠣（oyster）是一種低脂肪高蛋白的水產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)（45%～57%）、?；撬幔?0.6 mg/g）、總糖（18%～39%）和微量元素（硒、鋅）等，擁有極高的營養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值[1]。近十年來，我國牡蠣養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，年產(chǎn)量超過400萬 t[2]。鑒于牡蠣具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和較大的產(chǎn)量，蛋白質(zhì)酶解技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于牡蠣的水解，以獲得具有良好感官品質(zhì)、功能特性、生理活性和營養(yǎng)價(jià)值的酶解產(chǎn)物[3]。但獲得合適酶解產(chǎn)物受到多種因素的影響，包括酶種類、底物和水解條件（如酶的濃度、溫度、pH和時(shí)間）[4]。通過控制水解條件可以提高酶解產(chǎn)物的品質(zhì)和功能特性，如乳化性和起泡性[5]。適度酶解可以強(qiáng)化酶解產(chǎn)物的功能特性，但酶解過度會(huì)造成一些功能特性喪失[6]。因此，控制蛋白質(zhì)的水解程度對(duì)于獲得具有較佳功能特性的酶解產(chǎn)物至關(guān)重要。

水解度是表征蛋白質(zhì)水解程度的重要指標(biāo)。近年來，越來越多研究者關(guān)注水解度對(duì)水產(chǎn)品酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的影響。袁曉晴等[6]制備水解度為DH 4.5%，9.0%和13.5%鳙魚肉酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)DH 4.5%酶解產(chǎn)物乳化性和起泡性最高，而過度水解后，DH 9.0%和13.5%酶解產(chǎn)物乳化性和起泡性下降。馬艷芳等[7]發(fā)現(xiàn)螺旋藻肽的起泡性、DPPH清除率和還原力，隨著水解度增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，而泡沫穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性則隨著水解度增大而逐漸減小。周航等[8]制備水解度分別為7.5%，9.4%，10.3%，11.6%和14.6%的鰱魚肉酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化抑制率、ABTS+·清除率和還原力均隨水解度增大而升高。盧彬等[9]制備水解度分別為10.8%，14.9%，19.0%和21.7%鲹魚肉酶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)隨著水解度增大，酶解產(chǎn)物乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性逐漸降低。研究表明，水解度對(duì)酶解產(chǎn)物的功能特性和抗氧化活性有重要影響，且不同原料呈現(xiàn)不同規(guī)律。前期研究發(fā)現(xiàn)，水解度對(duì)牡蠣酶解液的感官評(píng)分、肽分子量分布和游離氨基酸組成有較大影響[10]。酶解產(chǎn)物組成的差異會(huì)引起其功能特性和生理活性變化。現(xiàn)鮮有水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性影響的報(bào)道。

因此，試驗(yàn)以牡蠣肉為原料，采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)其進(jìn)行限制性水解，獲得不同水解度的酶解產(chǎn)物，考察水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和總還原力）的影響，旨在為牡蠣酶解產(chǎn)物的工業(yè)化應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣肉（購自廣州龍洞農(nóng)貿(mào)市場，現(xiàn)場去殼取肉后，冰鮮保存，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-18 ℃凍藏）；風(fēng)味蛋白酶（酶活500 LAPU/g，諾維信中國公司）；胰蛋白酶（酶活4 000 U/g，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司）；2, 2-二苯基-1-苦味基肼（DPPH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；濃硫酸、氫氧化鈉、鹽酸等（均為分析純）。

DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；K9840凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；T25高壓均質(zhì)機(jī)（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解產(chǎn)物制備

稱取等重量解凍的牡蠣肉和蒸餾水，混合后迅速打漿，調(diào)整漿液pH 7.0，加入牡蠣肉總重量0.6%復(fù)合蛋白酶（胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比2︰1），攪拌均勻后在55 ℃水浴搖床中分別酶解不同時(shí)間。酶解結(jié)束后，煮沸滅酶20 min。室溫冷卻后在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min，取上清液-18 ℃凍存?zhèn)溆肹1]。酶解時(shí)間分別為0，30，60，240和480 min的酶解產(chǎn)物，分別標(biāo)記為OH0、OH1、OH2、OH3和OH4。

1.2.2 水解度測定

總氮含量測定采用凱氏定氮法。氨基酸態(tài)氮含量測定采用甲醛滴定法[11]。水解度（DH）按照式（1）計(jì)算。

1.2.3 乳化性能

酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋3倍后，取30 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物至燒杯中，分別調(diào)節(jié)pH 4，6，8和10，加入30 mL大豆油，以10 000 r/min均質(zhì)2 min，迅速將乳化液倒入100 mL離心管中，以3 000 r/min離心5 min，離心后測量乳化層體積[2-3]。

1.2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋3倍后，取30 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物至燒杯中，分別調(diào)節(jié)pH 4，6，8和10，以10 000 r/min高速均質(zhì)2 min后迅速轉(zhuǎn)移至量筒中，量取起始泡沫體積，記錄之后5，10，20，30和60 min時(shí)的泡沫體積[8]。起泡性及泡沫穩(wěn)定性按照式（3）和（4）計(jì)算。

1.2.5 DPPH的測定

酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋4倍后，取2 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物于10 mL離心管中，加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，混勻，室溫避光放置30 min。以無水乙醇調(diào)零，于517 nm波長處測定吸光度[4]。計(jì)算如式（5）。

式中：A0為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度；A1為2.0 mL DPPH溶液+2.0 mL無水乙醇的吸光度；A2為2.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 總還原力的測定

酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋1倍后，取1 mL稀釋后的酶解產(chǎn)物于10 mL離心管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，加2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻。以蒸餾水調(diào)零，于700 nm波長處測定吸光度[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度

蛋白質(zhì)水解后成為多肽和游離氨基酸，多肽是酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者。不同水解度的酶解產(chǎn)物中多肽分子量分布范圍和含量不同。通常水解度越高，多肽分子量分布范圍越小，小分子肽含量越高，但呈現(xiàn)較強(qiáng)功能特性和抗氧化活性的多肽分子量具體是多少，未有一個(gè)明確的參考依據(jù)。因此，探究水解度對(duì)酶解產(chǎn)物功能特性和抗氧化活性的影響，是酶解產(chǎn)物中功能性肽和抗氧化肽分離和鑒定的基礎(chǔ)，也是酶解產(chǎn)物應(yīng)用的基礎(chǔ)。如圖1所示，采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)牡蠣進(jìn)行限制性水解，酶解時(shí)間分別為0，30，60，240和480 min時(shí)，獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產(chǎn)物，水解度分別為8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%。牡蠣在貯藏和預(yù)處理過程中，其中的內(nèi)源蛋白酶也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，發(fā)生蛋白質(zhì)自溶的過程[6]。因此，酶解時(shí)間0 min的牡蠣酶解產(chǎn)物，其水解度也需要被測定和考察。

圖1 牡蠣酶解產(chǎn)物的水解度

2.2 乳化性

乳化性是指能將油水結(jié)合在一起形成乳狀液的能力，是食品加工中重要的性質(zhì)和質(zhì)量控制指標(biāo)。如圖2所示，在pH 4環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.46%，42.29%，44.61%，42.81%和43.76%。在pH 6環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為44.44%，45.13%，45.81%，43.75%和43.03%。在pH 8環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為45.82%，44.56%，43.08%，43.44%和44.27%。在pH 10環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4乳化性分別為41.98%，41.82%，39.97%，39.81%和40.38%。數(shù)據(jù)分析表明，不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物在不同pH環(huán)境中的乳化性差別較小，表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物乳化性的影響較小。

圖2 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的乳化性

2.3 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

起泡性是蛋白質(zhì)應(yīng)用于食品加工的一項(xiàng)重要功能性質(zhì)。如圖3所示，在pH 4環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為53.84%，56.39%，26.92%，21.40%和16.53%。在pH 6環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為68.15%，70.07%，58.55%，40.99%和29.59%。在pH 8環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為52.57%，51.82%，37.56%，24.96%和13.79%。在pH 10環(huán)境中，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4起泡性分別為46.13%，55.41%，31.53%，36.11%和18.69%。數(shù)據(jù)分析表明，OH1在4種pH環(huán)境中均有較強(qiáng)的起泡性，在pH 6環(huán)境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環(huán)境中，牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在pH 8環(huán)境中，牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在pH 10環(huán)境中，牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性則無明顯規(guī)律。表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物起泡性的影響較大。

由圖4可知，在pH 4環(huán)境中，OH3和OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng)，泡沫穩(wěn)定性5 min時(shí)分別為93.27%和92.06%。OH1在5，10，20，30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為76.74%，75.58%，70.93%，62.79%和23.26%，表明OH1在pH 4環(huán)境中，30 min內(nèi)具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖5可知，在pH 6環(huán)境中，OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng)，泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為96.67%。OH1在5，10，20，30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為68.08%，64.32%，58.69%，56.34%和28.17%。表明OH1在pH 6環(huán)境中，30 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖6可知，在pH 8環(huán)境中，OH3和OH4的泡沫穩(wěn)定性較強(qiáng)，泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為分別為91.60%和95.34%。OH1在5，10，20，30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 8環(huán)境中，60 min內(nèi)具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。由圖7可知，在pH 10環(huán)境中，OH1、OH2、OH3和OH4均具有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性，泡沫穩(wěn)定性在5 min時(shí)為分別為85.63%，85.36%，84.30%和84.30%。OH1在5，10，20，30和60 min時(shí)的泡沫穩(wěn)定性分別為77.07%，73.89%，68.79%，64.33%和50.89%。表明OH1在pH 10環(huán)境中，60 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。

圖3 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性

圖4 pH 4時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性

圖5 pH 6時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性

圖6 pH 8時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性

圖7 pH 10時(shí)不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性

數(shù)據(jù)分析表明，OH4在4種pH環(huán)境中均有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性。OH1在pH 4和6環(huán)境中，30 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。在pH 8和10環(huán)境中，60 min內(nèi)仍具有超過50%的泡沫穩(wěn)定性。表明水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性的影響也較大。

2.4 DPPH清除率

DPPH清除率是表征抗氧化劑體外抗氧化活性的重要指標(biāo)。DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，溶于乙醇時(shí)溶液呈深紫色，有自由基清除劑存在時(shí)，可與其單電子配對(duì)使其溶液褪色，吸光度下降，其褪色程度與自由基清除能力呈正相關(guān)。如圖8所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的DPPH清除率分別為35.33%，67.00%，66.00%，76.00%和72.67%。牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率，隨著水解度增加，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。牡蠣經(jīng)酶解后，其DPPH清除率提高將近1倍，原因可能是酶的作用使原本隱藏在牡蠣蛋白質(zhì)內(nèi)部并且能夠增強(qiáng)肽抗氧能力的氨基酸殘基暴露出來，生成單電子配對(duì)能力強(qiáng)的產(chǎn)物，易于與DPPH結(jié)合。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。隨著水解度增加，OH4的DPPH清除率有所下降，可能因?yàn)榭寡趸钚噪倪^度水解，單電子配對(duì)能力強(qiáng)的產(chǎn)物生成量下降，從而導(dǎo)致DPPH清除率降低。這與馬艷芳等[7]報(bào)道螺旋藻肽的DPPH清除率規(guī)律一致，隨著水解度增加，螺旋藻肽的DPPH清除率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。

2.5 總還原力

在總還原力測定中，700 nm處的吸光度與樣品的還原能力成正比。吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。如圖9所示，OH0、OH1、OH2、OH3和OH4的總還原力分別為0.296，0.304，0.318，0.367和0.395。牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力，隨著水解度增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。這與周航等[8]報(bào)道鰱魚酶解產(chǎn)物總還原力的規(guī)律一致，鰱魚酶解產(chǎn)物總還原力隨水解度增加，吸光度逐漸增大，總還原力逐漸增強(qiáng)。

圖8 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率

圖9 不同水解度牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成復(fù)合酶對(duì)牡蠣進(jìn)行限制性水解，獲得OH0、OH1、OH2、OH3和OH4這5種酶解產(chǎn)物，水解度分別為8.02%，24.75%，28.04%，36.98%和41.20%，考察水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物功能特性（乳化性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性）和抗氧化活性（DPPH清除率和總還原力）的影響。結(jié)果表明，水解度對(duì)牡蠣酶解產(chǎn)物乳化性影響較小，對(duì)起泡性、泡沫穩(wěn)定性、DPPH清除率和總還原力影響較大。OH1在pH 4，6，8和10環(huán)境中均有較強(qiáng)的起泡性，在pH 6環(huán)境中起泡性最大為70.07%。在pH 4和6環(huán)境中，隨著水解度增加，牡蠣酶解產(chǎn)物起泡性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。在pH 8環(huán)境中，牡蠣酶解產(chǎn)物的起泡性隨著水解度的增加呈現(xiàn)逐漸降低趨勢。OH4在pH 4，6，8和10環(huán)境中均有較強(qiáng)的泡沫穩(wěn)定性。牡蠣酶解產(chǎn)物的DPPH清除率，隨著水解度增加，呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。OH3的DPPH清除率最高為76.00%。牡蠣酶解產(chǎn)物的總還原力，隨著水解度增加呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。OH4的總還原力最高，為0.395。