治療缺血性腦卒中的網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)研究*

諶愛(ài)華，蔣 冰，王妙華，吳嘉萍，楊雨婷，賀福元,2△，鄧凱文,3△

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.中藥成藥性與制劑制備湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

缺血性腦卒中屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，是由各種原因造成局部腦組織血液供應(yīng)障礙，引發(fā)的腦組織缺血缺氧性壞死，如不經(jīng)及時(shí)治療，對(duì)患者的生活質(zhì)量及生活自理能力產(chǎn)生極大影響，且有較高的致殘、致死和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。我國(guó)每年新發(fā)腦卒中人數(shù)逐漸增多，速率增長(zhǎng)迅速，遠(yuǎn)高于全球平均水平[1]。腦缺血后神經(jīng)元損傷一旦超過(guò)治療時(shí)間窗，就無(wú)法自然修復(fù)，造成嚴(yán)重后果，故探討其發(fā)病機(jī)制及有效防治措施，是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。針刺治療缺血性腦卒中療效顯著，但其治病機(jī)制尚未完全闡明[2]。隨著現(xiàn)代生物分子網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展及各學(xué)科的交叉滲透，基于“網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)”“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”的發(fā)展，“網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)”也應(yīng)運(yùn)而生，常規(guī)的關(guān)于針刺效應(yīng)機(jī)制的研究多為單一因素的研究，對(duì)于最終效應(yīng)產(chǎn)生的各個(gè)過(guò)程的研究十分匱乏，且對(duì)于各個(gè)環(huán)節(jié)之間的相互影響、相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系了解甚少，缺乏系統(tǒng)的研究和規(guī)律的提煉，也未與其他學(xué)科相交流，對(duì)于針灸現(xiàn)代化的研究推動(dòng)作用較小。網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)[3]是在“疾病-穴位-基因-靶點(diǎn)”相互作用關(guān)系基礎(chǔ)上，與邊緣學(xué)科相互融合，運(yùn)用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析手段，研究穴位的配伍及產(chǎn)生效果的生物學(xué)機(jī)制，其研究重點(diǎn)是在可視化生物分子網(wǎng)絡(luò)中反映穴位效應(yīng)、病證的關(guān)系，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)觀察穴位對(duì)疾病的干預(yù)和影響，發(fā)現(xiàn)腧穴配伍的功能和作用機(jī)制。郭義教授[4]指出，針刺效應(yīng)的產(chǎn)生是針刺啟動(dòng)穴位局部“穴網(wǎng)絡(luò)”，從而調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫大網(wǎng)絡(luò)，最終作用于靶器官“病網(wǎng)絡(luò)”，至于如何從“小網(wǎng)絡(luò)”影響到“大網(wǎng)絡(luò)”，其過(guò)程十分繁雜，只有將各個(gè)部分建立相互聯(lián)系、相互影響的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型，才能解決針灸作用規(guī)律。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)方法，以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)建立穴位、靶點(diǎn)及缺血性腦卒中之間的關(guān)系，探究針刺治療缺血性腦卒中的有效穴位及主要作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

檢索中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫(kù)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)和維普中文期刊數(shù)據(jù)庫(kù)中的文獻(xiàn)。檢索時(shí)限：2009年7月—2019年7月。檢索方式：主題詞檢索。檢索詞：“針刺”“針灸”+“腦缺血”“缺血性腦卒中”“缺血性卒中”“腦梗死”“腦梗塞”“腦栓塞”“缺血性中風(fēng)”“MCAO”“大腦中動(dòng)脈缺血”“大腦中動(dòng)脈栓塞”“大腦中動(dòng)脈阻塞”“大腦中動(dòng)脈梗阻”“大腦中動(dòng)脈閉塞”。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)

①以毫針或電針治療腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)；②與分子機(jī)制相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究；③碩博士論文中關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分子機(jī)制方面的研究；④腦缺血再灌注；⑤文獻(xiàn)所選取腧穴有具體定位及歸經(jīng)。

1.3 文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并其他方法治療腦缺血的文獻(xiàn)；②腦缺血合并其他疾病的文獻(xiàn)；③無(wú)具體腧穴定位及歸經(jīng)的文獻(xiàn)；④臨床研究、系統(tǒng)評(píng)價(jià)、Meta分析和綜述類文獻(xiàn)；⑤會(huì)議論文；⑥除外耳穴、眼針等療法；⑦重復(fù)文獻(xiàn)(保留發(fā)表文獻(xiàn)最近的1篇)。

1.4 建立數(shù)據(jù)庫(kù)

對(duì)篩選、納入的文獻(xiàn)進(jìn)行整理，數(shù)據(jù)錄入到Excel電子表格保存，根據(jù)穴位、穴位歸經(jīng)、靶點(diǎn)名稱、針刺效應(yīng)和文獻(xiàn)來(lái)源等進(jìn)行分類整理。參考《經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)》，對(duì)穴位名稱與歸經(jīng)進(jìn)行規(guī)范化處理。將符合要求的數(shù)據(jù)建立針刺治療缺血性腦卒中的“經(jīng)脈-穴位-靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)”。

1.5 分析軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)

Cytoscape 3.6.1軟件；DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 頻次分析

通過(guò)上述檢索方式及參照納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)有437篇，共涉及腧穴65個(gè)，取穴頻次最多的為百會(huì)穴，達(dá)278次；屬于特定穴的腧穴有51個(gè)，使用最多的特定穴為五輸穴，共21個(gè)，其次為交會(huì)穴，共19個(gè)；督脈選用頻次最高，共686次，選用穴位數(shù)量最多的經(jīng)脈為足少陽(yáng)膽經(jīng)，共計(jì)11個(gè)腧穴；文獻(xiàn)中共涉及靶點(diǎn)371個(gè)，其中TNF-ɑ及GFAP使用頻次最多，各24次。

2.2 經(jīng)脈-穴位-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

Cytoscape3.6.1軟件為一種能將網(wǎng)絡(luò)可視化，并能進(jìn)行分析的系統(tǒng)軟件，可通過(guò)生物分子相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化的形式將高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)、分子狀態(tài)信息有機(jī)整合在一起，將其用節(jié)點(diǎn)與邊的形式表現(xiàn)出來(lái)，便于較直觀地觀察網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系。用該軟件構(gòu)建經(jīng)脈-穴位-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)network analyzer分析穴位與靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)特征，計(jì)算節(jié)點(diǎn)的度值(degree)及中介中心性(betweenness)，觀察針刺穴位與缺血性腦卒中靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)情況，評(píng)價(jià)穴位及靶點(diǎn)的拓?fù)湎嚓P(guān)性。缺血性腦卒中經(jīng)脈-穴位-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。

注:藍(lán)色代表經(jīng)脈，紅色代表穴位，綠色代表靶點(diǎn)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)屬性

本網(wǎng)絡(luò)中共涉及450個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括371個(gè)靶點(diǎn)，腧穴65個(gè)，經(jīng)脈14條,如表1～2所示。節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)，度值越大，其相關(guān)性越高。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的選擇

將表1中的371個(gè)靶點(diǎn)的度值進(jìn)行降序排列，并計(jì)算所有靶點(diǎn)的累計(jì)百分比，選取計(jì)算結(jié)果≥70%的臨界靶點(diǎn)及其之前的靶點(diǎn)，共計(jì)149個(gè)，將該149個(gè)靶點(diǎn)與樊啟猛等[5]人研究的與缺血性腦卒中緊密相關(guān)的46個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行重合，篩選出相同靶點(diǎn)，相同的靶點(diǎn)代表針刺治療缺血性腦卒中的有效靶點(diǎn)，重合后共計(jì)有18個(gè)靶點(diǎn)，分別為TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin；同時(shí)按上述方法計(jì)算65個(gè)穴位度值的累計(jì)百分比，選取累計(jì)百分比≥60%的臨界穴位及之前的穴位，共計(jì)8個(gè)，分別為百會(huì)、水溝、足三里、內(nèi)關(guān)、曲池、大椎、合谷及神庭。

表1 與針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的靶點(diǎn)(按度值大小排序)

表2 針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的穴位(按度值大小排序)

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)為生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，為大量基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息，常用的主要有g(shù)ene ID的轉(zhuǎn)換、差異基因的功能注釋和通路富集分析。用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，GO富集分析共收集到170條相關(guān)結(jié)果，根據(jù)P<0.000 01，有8條符合要求,如表3所示，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因功能信息主要富集于胚胎植入、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)磷酸化、激活MAPK活性、卵巢卵泡發(fā)育和對(duì)藥物的反應(yīng)等方面；KEGG信號(hào)通路顯示，針刺治療腦缺血靶點(diǎn)涉及的KEGG通路共有57條，根據(jù)P<0.000 01，發(fā)現(xiàn)靠前的通路主要有8條,如表4所示，分別與MAPK信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Pertussis、Tuberculosis及Chagas disease(American trypanosomiasis)等相關(guān)。

表3 針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)富集信息(P<0.000 01)

表4 針刺治療缺血性腦卒中關(guān)鍵靶點(diǎn)通路信息(P<0.000 01)

3 討論

本研究基于文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)與針刺治療缺血性腦卒中相關(guān)的腧穴有65個(gè)，其中百會(huì)穴選用次數(shù)最多，達(dá)278次；屬于特定穴的腧穴有51個(gè)，使用最多的特定穴為五輸穴，共21個(gè)，督脈選用次數(shù)最多，達(dá)686次；足少陽(yáng)膽經(jīng)選用腧穴數(shù)目最多，共11個(gè)；涉及靶點(diǎn)有371個(gè)，其中TNF-ɑ及GFAP使用頻次最多，各24次。通過(guò)構(gòu)建經(jīng)脈-穴位-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵穴位共計(jì)8個(gè)，分別為百會(huì)、水溝、足三里、內(nèi)關(guān)、曲池、大椎、合谷與神庭，主要涉及督脈、足陽(yáng)明胃經(jīng)、手陽(yáng)明大腸經(jīng)和手厥陰心包經(jīng)；其治療關(guān)鍵靶點(diǎn)共18個(gè)，分別為TNF-α、CASP3、IL-1β、Bcl-2、MMP-9、SOD、IL-6、NF-κB、BDNF、ICAM-1、TGF-β、P38MAPK、AIF、MMP-2、VEGFR2、ERK1、HO-1及P-selectin。

缺血性腦卒中主要原因?yàn)槟X血管閉塞不通、腦功能異常，從而導(dǎo)致神志障礙及肢體感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)障礙。針刺治療時(shí)多選用頭局部穴位及患側(cè)肢體穴位。百會(huì)位于督脈，為足厥陰肝經(jīng)、六陽(yáng)經(jīng)和督脈交會(huì)穴，可開(kāi)竅醒神、平肝熄風(fēng)，能顯著降低大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀[6]。水溝亦屬督脈經(jīng)穴，為督脈與手足陽(yáng)明經(jīng)之交會(huì)穴，可通督醒腦、開(kāi)竅醒神，能有效抑制缺血側(cè)半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡及降低鈣離子濃度，減輕缺血缺氧所造成的損傷程度[7]。內(nèi)關(guān)屬手厥陰心包經(jīng)，為絡(luò)穴、八脈交會(huì)穴，通于陰維脈，可養(yǎng)心安神，能通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移來(lái)加速新血管的形成[8]。大椎位于督脈，為六陽(yáng)經(jīng)與督脈交會(huì)穴，可調(diào)神通督、匡扶陽(yáng)氣，改善腦缺血后的神經(jīng)功能障礙[9]。陽(yáng)明經(jīng)穴在治療本病時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯，手足陽(yáng)明經(jīng)均為多氣多血之經(jīng)，治療本病時(shí)也常取此二經(jīng)穴位，足三里與曲池分屬足陽(yáng)明胃經(jīng)與手陽(yáng)明大腸經(jīng)的合穴，經(jīng)脈經(jīng)氣可通過(guò)合穴深入于臟腑，故針刺陽(yáng)明經(jīng)之合穴，可補(bǔ)氣養(yǎng)血、平調(diào)臟腑功能，且研究顯示[10]，針刺曲池和足三里能促進(jìn)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，縮小腦部缺血區(qū)面積。合谷屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)，可疏風(fēng)舒筋、行氣活血，刺之可增加局部筋脈氣血的濡養(yǎng)，且可激活同側(cè)小腦后葉上半月小葉以及對(duì)側(cè)小腦后葉下半月小葉[11]。神庭屬督脈，為督脈與膀胱經(jīng)、胃經(jīng)之交會(huì)穴，可益智醒神開(kāi)竅，明顯提高患者認(rèn)知功能[12]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，缺血性腦卒中發(fā)生的根本原因在于大腦供血?jiǎng)用}被栓子堵塞，缺血側(cè)腦組織因急性缺血缺氧而引發(fā)炎癥反應(yīng)、微血栓形成、腦細(xì)胞能量衰竭與缺氧去極化、自由基的毒性作用、Ca2+超載的細(xì)胞毒、興奮性氨基酸毒性損傷與細(xì)胞凋亡等一系列過(guò)程[13]。通過(guò)分析所得18個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB、ICAM-1及P38MAPK主要參與缺血后炎癥反應(yīng)，CASP3、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、AIF、ERK1與細(xì)胞壞死及凋亡相關(guān)，SOD、HO-1主要調(diào)控缺血后氧化應(yīng)激反應(yīng)，P-selectin主要參與血栓形成，BDNF、TGF-β主要參與神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)，VEGFR2與血管新生關(guān)系密切。腦缺血發(fā)生后，包括TNF-α、IL在內(nèi)的炎癥因子大量表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)；同時(shí)，體內(nèi)ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致局部血管損傷、微循環(huán)血流動(dòng)力學(xué)障礙[14]；氧自由基大量蓄積，且清除率低，可加重炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程，體內(nèi)SOD及HO-1能調(diào)控機(jī)體氧化與抗氧化平衡[15]；Bcl-2和Bax比例失衡，使大量促凋亡因子被釋放到胞質(zhì)中，從而和Caspase家族結(jié)合，啟動(dòng)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[16-17]；p38MAPK可參與多個(gè)過(guò)程，從不同方面對(duì)腦損傷產(chǎn)生影響[18]；ERK1/2信號(hào)通路可介導(dǎo)缺損傷后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的壞死及凋亡[19]；P-selectin在腦缺血缺氧發(fā)生后，可增加血小板聚集于血管內(nèi)皮細(xì)胞上，對(duì)血流造成影響，促進(jìn)血栓形成[20]。腦缺血后除產(chǎn)生神經(jīng)功能缺損外，也啟動(dòng)了機(jī)體自我保護(hù)和修復(fù)機(jī)制，如BDNF分泌增加，可促進(jìn)神經(jīng)元再生、分化及修復(fù)[21]；缺血缺氧還可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)增加，加速建立腦部側(cè)支循環(huán)，改善局部血供[22]。實(shí)驗(yàn)研究顯示，針刺可降低腦缺血大鼠體內(nèi)的IL-1β、IL-6、NF-κB和IL-8含量，減輕與其相關(guān)的各種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而抵抗腦缺血[23]；還可增強(qiáng)腦缺血大鼠體內(nèi)SOD及HO-1的分泌，降低MDA含量，提高機(jī)體對(duì)氧自由基清除能力[23-26]；也能通過(guò)提高VEGF水平，加速腦缺血后新生血管形成[27]；還可增加BDNF含量來(lái)達(dá)到修復(fù)缺血后神經(jīng)損傷的目的[28]；通過(guò)上調(diào)MK、下調(diào)CASP3及介導(dǎo)ERK/JNK/P38信號(hào)通路來(lái)營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，減少細(xì)胞凋亡[29-30]。

通過(guò)GO基因分析及KEGG富集通路分析，發(fā)現(xiàn)針刺治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因富集信息涉及170條，主要富集于胚胎植入、細(xì)胞外空間、蛋白質(zhì)磷酸化、激活MAPK活性、脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路、細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、卵巢卵泡發(fā)育和對(duì)藥物的反應(yīng)，針刺治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)富集通路有57條，主要與TNF signaling pathway、Pertussis、Tuberculosis、Chagas disease(American trypanosomiasis)、Proteoglycans in cancer、Malaria、Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)及NOD-like receptor signaling pathway等相關(guān)。通過(guò)以上分析，本研究預(yù)測(cè)針刺很可能通過(guò)P38MAPK、MMP-9、TNF-α、ERK-1、IL-1β、IL-6、CASP3及ICAM-1等關(guān)鍵靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)TNF、NOD等信號(hào)通路，從而抑制炎癥反應(yīng)、減輕細(xì)胞凋亡等過(guò)程，達(dá)到治療腦缺血的目的。此外，某一個(gè)信號(hào)通路可能與多個(gè)疾病相關(guān)，也為針刺通過(guò)該信號(hào)通路治療其他相關(guān)疾病提供可能。

中醫(yī)整體觀念認(rèn)為人作為一個(gè)有機(jī)整體，針刺通過(guò)穴位刺激可調(diào)控整個(gè)人體網(wǎng)絡(luò)，可多靶點(diǎn)、多通路和多環(huán)節(jié)對(duì)缺血性腦卒中產(chǎn)生影響，而不是簡(jiǎn)單的“針刺-效應(yīng)”兩點(diǎn)關(guān)系，其產(chǎn)生效應(yīng)也并不僅僅局限于實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)中，許多未知的數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步研究，但目前研究多處于多個(gè)穴位對(duì)幾個(gè)靶點(diǎn)的影響作用上，未能系統(tǒng)、整體描述其治病機(jī)制，且對(duì)單穴治療缺血性腦卒中的靶點(diǎn)通路的研究也十分缺乏，筆者基于文獻(xiàn)研究，借助網(wǎng)絡(luò)針灸學(xué)方法，從網(wǎng)絡(luò)層次探究針刺治療缺血性腦卒中的生物學(xué)機(jī)制，對(duì)理解針刺對(duì)缺血性腦卒中靶點(diǎn)作用關(guān)系提供了重要信息，為進(jìn)一步探究針刺治療缺血性腦卒中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。