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    低頻電針“胃脘下俞”對2型糖尿病大鼠胰腺形態(tài)和分泌功能的調(diào)控作用研究*

    2021-06-11 01:51:22曹昺焱高譽(yù)珊張淑靜
    針灸臨床雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:胃脘胰島電針

    曹昺焱,李 瑞,陳 卓,肖 京,高譽(yù)珊,張淑靜

    (1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,北京 100091;2.北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

    糖尿病是位列心血管疾病、腫瘤之后的第三大損害人類生命和健康的非傳染性疾病[1]。流行病學(xué)顯示我國2013年糖尿病患病率為10.4%,其中絕大多數(shù)為2型糖尿病[2]。2型糖尿病的致病因素有:①胰島B細(xì)胞形態(tài)、功能受損;②肝、脂肪和骨骼肌等胰島素的主要靶細(xì)胞胰島素抵抗[3]。針灸是WHO認(rèn)可的糖尿病可行治療手段之一[4],其相關(guān)記載見于《備急千金要方》曰:“消渴咽喉干,灸胃管下俞三穴各百壯”。有研究表明,電針“胃脘下俞”能顯著降低模型動物空腹血糖[5-6]、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇[7]等指標(biāo),并顯著改善胰島素抵抗指數(shù)和胰島素敏感指數(shù)[8],其機(jī)理涉及上調(diào)骨骼肌胰島素信號通路,改善胰腺形態(tài)和功能[9-10]。胃脘下俞穴位于背俞功能帶上,其所在的T8脊神經(jīng)節(jié)位于支配胰腺傳入神經(jīng)節(jié)的中心,其具有調(diào)節(jié)胰腺形態(tài)和功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。對胃脘下俞穴進(jìn)行刺激理應(yīng)能通過神經(jīng)傳導(dǎo)改善胰腺形態(tài)和分泌功能,達(dá)到降低血糖的作用。本研究以胰高血糖素樣肽1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)為切入點(diǎn),探討低頻電針對2型糖尿病大鼠胰腺形態(tài)和功能的干預(yù)作用,為電針胃脘下俞穴降糖作用提出解釋。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物

    實(shí)驗(yàn)動物為體質(zhì)量(155±5)g的雄性清潔級SD大鼠[斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2011-004]。動物于23°C恒溫、60%恒濕、晝夜循環(huán)光照和自由飲食水的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,依體質(zhì)量隨機(jī)選取13只大鼠為空白組,不造模。其余大鼠以高脂飲食飼養(yǎng)結(jié)合腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)制備2型糖尿病大鼠模型。成模動物根據(jù)空腹血糖隨機(jī)分為模型組、電針組,每組12只。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:BUCM-3-2013090401-3001)。

    1.2 主要試劑與儀器

    普通飼料及高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司);鏈脲佐菌素、檸檬酸和二水檸檬酸鈉(美國Sigma公司);羅氏血糖儀(GC12723032)、羅氏血糖試紙(LOT24626232)(德國Roche公司);Masson染色試劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司);KWD-808電針(常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司);無菌針灸針(LOT031426,北京中研太和醫(yī)藥有限公司);Legend micr017r離心機(jī)(美國Thermo公司);BX53顯微鏡(奧林巴斯公司);GLP-1受體多克隆抗體(LOT:GR193702-1,美國Abcam公司)。

    1.3 模型制備

    造模動物經(jīng)7周配方為70%普通飼料、10%蔗糖、10%豬油和10%蛋黃粉的高脂飼料喂養(yǎng)后,禁食過夜。次日以2%的STZ溶液(溶液配置:0.1 mol/L檸檬酸緩沖液和0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液按1.3∶1比例混勻,按20 mg/mL的質(zhì)量體積比溶解STZ粉末;STZ溶液制備于冰上完成,30 min內(nèi)完成注射)按照35 mg/kg的比例腹腔注射。于STZ注射后72 h檢測大鼠隨機(jī)血糖(Random blood glucose,RBG);于STZ注射14 d后進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(Oral glucose tolerance test,OGTT)。RBG>16.7 mmol/L且OGTT 2 h血糖>11.1 mmol/L者判定為成模,并隨機(jī)分為模型組、電針組。

    自評估成模之日起,模型組、電針組改以普通飼料喂養(yǎng)。

    1.4 干預(yù)方法

    1.4.1 空白組及模型組 不進(jìn)行電針干預(yù)。

    1.4.2 電針組 以0.16 mm×7 mm針灸針向內(nèi)斜刺雙側(cè)“胃脘下俞”穴(穴位定位于大鼠第8胸椎棘突下旁開5 mm[11]),針刺深度4 mm。雙側(cè)穴位均接通電針。電針正極連接針刺“胃脘下俞”穴的針灸針針柄,負(fù)極連接于粘貼在大鼠同側(cè)后足上的以0.9%氯化鈉溶液浸濕的棉球,形成回路。電針參數(shù):2 Hz連續(xù)波,電流強(qiáng)度2 mA。留針20 min,6次/周,共4周。

    1.5 取材和指標(biāo)檢測

    1.5.1 空腹血糖檢測 全部動物于末次治療結(jié)束后禁食過夜,次日早8:00尾尖取血測空腹血糖(Fasting blood glucose,F(xiàn)BG)。

    1.5.2 空腹胰島素檢測 測空腹血糖后,動物以2%戊巴比妥納溶液按照45 mg/kg比例腹腔注射麻醉,腹主動脈取血。血樣本于室溫靜置凝固后,于4 ℃環(huán)境下3 000 r/min離心15 min,分離血清。由北京華英生物技術(shù)研究所以酶免法檢測空腹胰島素含量。

    1.5.3 胰島B細(xì)胞分泌功能檢測 B細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B)=20×空腹胰島素/(空腹血糖-3.5)。

    1.5.4 胰腺形態(tài)學(xué)檢測 以HE染色和Masson染色觀察:動物腹主動脈取血致死后,取相同部位胰腺組織于20倍體積的波恩氏液固定72 h;此后經(jīng)石蠟包埋,制備5 μm連續(xù)切片。HE染色步驟:切片以二甲苯脫蠟2次,每次15 min,以100%、100%、95%、90%、80%和70%濃度的下行梯度乙醇水溶液脫二甲苯,每濃度5 min。去離子水中浸泡5 min后,以蘇木素染色5 min,流水稍沖,以鹽酸乙醇分化10 s,自來水浸泡15 min,以70%、80%、90%、95%、100%和100%濃度的上行梯度乙醇水溶液脫水,每濃度5 min,以二甲苯脫酒精2次,每次10 min,中性樹脂封片。40倍光鏡觀察胰島結(jié)構(gòu)。Masson染色步驟:切片以HE染色相同方法脫蠟、下行梯度乙醇脫二甲苯至去離子水后,于去離子水中浸泡5 min,滴試劑A(復(fù)合染色液)一滴搖勻,使試劑均勻覆蓋切片組織,染色5 min,以去離子水沖掉試劑后,于去離子水中浸泡15 min;滴試劑C(磷鉬酸)一滴搖勻,使試劑均勻覆蓋切片組織,甩去試劑C,以去離子水稍沖;滴試劑D(苯胺藍(lán))一滴搖勻,使試劑均勻覆蓋組織切片,染色6 min,甩去試劑D,去離子水稍沖;滴試劑B(分化液)一滴,分化30 s。染色后的切片以去離子水浸泡3次,每次3 min后,以HE染色相同方法上行梯度乙醇脫水至二甲苯,以中性樹脂封片。以40倍光鏡觀察胰島纖維化(藍(lán)綠染色)。

    1.5.5 胰腺GLP-1受體蛋白表達(dá)檢測 以western blot法檢測:100 mg胰腺組織于1 mL含蛋白酶抑制劑的裂解液中冰上研磨勻漿。取勻漿液10 000 r/min離心15 min。取上清液配平,煮沸變性后,上樣,以120 V電泳60 min;以80 V電轉(zhuǎn)70 min,將蛋白濕轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上,5%牛奶-TBST溶液室溫孵育1 h,加入1∶2 000稀釋的一抗,室溫孵育1 h后于4 ℃環(huán)境下孵育過夜。此后經(jīng)洗膜,二抗孵育后,于暗室曝光。

    1.5.6 數(shù)據(jù)處理 以Image-Pro Plus6.0 軟件計(jì)算條帶IOD(Integrated option density,總灰度值)作為表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算胰腺GLP-1受體相對表達(dá)。本檢測重復(fù)3次,以平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 低頻電針對2型糖尿病大鼠血糖的調(diào)控作用

    表1所示,治療前,模型組、電針組大鼠空腹血糖均顯著高于空白組(P<0.01);模型組、電針組大鼠FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4周干預(yù)結(jié)束后,模型組、電針組大鼠FBG仍顯著高于空白組(P<0.01);其中電針組大鼠FBG較模型組顯著降低(P<0.05)。上述結(jié)果提示以2 Hz、2 mA的低頻連續(xù)波電針刺激“胃脘下俞”可顯著降低2型糖尿病大鼠血糖。

    表1 電針干預(yù)前后空腹血糖

    2.2 低頻電針對2型糖尿病大鼠胰島形態(tài)的調(diào)控作用

    低頻電針干預(yù)后2型糖尿病大鼠胰島,HE染色如圖1示:空白組大鼠胰島呈規(guī)則的橢圓形,胰島形態(tài)飽滿,胰島B細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)、顏色正常,胰島與外周的外分泌腺泡細(xì)胞之間邊界清晰;模型組大鼠胰島面積明顯縮小,胰島外周的外分泌腺泡細(xì)胞變大,部分侵入胰島,胰島形態(tài)不規(guī)則,其中,胰島B細(xì)胞核數(shù)量減少,顏色變深;電針組大鼠胰島面積介于空白組和模型組之間,胰島外周的外分泌腺泡細(xì)胞變大,細(xì)胞間隙變小,胰島形態(tài)稍不規(guī)則,胰島中仍可見部分代償增大的B細(xì)胞核,胰島B細(xì)胞核數(shù)量較模型組稍增多。

    圖1 低頻電針干預(yù)后2型糖尿病大鼠胰島形態(tài)學(xué)觀察(HE染色,40×,標(biāo)尺示50 μm)

    低頻電針干預(yù)后2型糖尿病大鼠胰島Masson染色,如圖2示:空白組大鼠胰島形態(tài)呈橢圓形,胰島外周均勻包繞一層藍(lán)色的薄層纖維,胰島內(nèi)部偶爾可見少量分布的纖維;模型組大鼠胰島面積縮小,形態(tài)不規(guī)則,胰島B細(xì)胞及細(xì)胞核顏色變深,胰島內(nèi)可見大量深藍(lán)色的纖維侵入,貫穿整個胰島;電針組大鼠胰島面積縮小,形態(tài)不規(guī)則較模型組稍改善,胰島B細(xì)胞及細(xì)胞核顏色變深,較模型組略好轉(zhuǎn),胰島中仍可見藍(lán)色的纖維侵入,纖維顏色較模型組稍變淺。

    圖2 低頻電針干預(yù)后2型糖尿病大鼠胰島形態(tài)學(xué)觀察(Masson染色,40×,標(biāo)尺示50 μm)

    上述結(jié)果示,低頻連續(xù)波電針“胃脘下俞”可保護(hù)2型糖尿病大鼠胰腺形態(tài),在一定程度上改善胰島纖維化和外分泌腺泡細(xì)胞對胰島的侵蝕。

    2.3 低頻電針對2型糖尿病大鼠胰島素分泌功能的調(diào)控作用

    表2所示,4周干預(yù)后,空白組、模型組和電針組空腹胰島素含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組、電針組胰島素分泌指數(shù)顯著低于空白組(P<0.01);其中電針組胰島素分泌指數(shù)顯著優(yōu)于模型組(P<0.05)。上述結(jié)果示低頻連續(xù)波電針“胃脘下俞”對保護(hù)胰島素分泌功能有顯著作用。

    表2 各組大鼠胰島素分泌比較

    2.4 低頻電針對2型糖尿病大鼠胰腺GLP-1受體蛋白表達(dá)的調(diào)控作用

    圖3、表3所示,空白組胰腺GLP-1受體蛋白表達(dá)顯著高于模型組(P<0.01)。經(jīng)過4周電針干預(yù)后,電針組胰腺GLP-1受體含量顯著高于模型組(P<0.05),但仍顯著低于空白組(P<0.05)。

    圖3 各組大鼠胰腺GLP-1R蛋白表達(dá)

    表3 各組大鼠胰腺GLP-1R蛋白相對表達(dá)量

    3 討論

    3.1 穴位選取依據(jù)

    2型糖尿病屬西醫(yī)病名,該病隸屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇。胃脘下俞穴是首個明確見于中醫(yī)古籍記載的可用于消渴病治療的穴位?!秱浼鼻Ы鹨健费裕骸跋恃屎砀?,灸胃管下俞三穴各百壯”。實(shí)驗(yàn)研究表明,該穴可顯著降低2型糖尿病大鼠空腹血糖[5-6]、血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇[7]等指標(biāo)。其機(jī)理既涉及改善胰腺形態(tài)和功能[9-10];也涉及調(diào)控胰島素抵抗[8]。即胃脘下俞穴可同時對2型糖尿病的兩大致病機(jī)理,胰島形態(tài)、分泌功能受損和肝、脂肪、骨骼肌等外周靶細(xì)胞的胰島素抵抗起干預(yù)作用。

    胃脘下俞穴的上述作用可部分通過現(xiàn)代神經(jīng)解剖學(xué)得到解釋:該穴位于第8胸椎棘突下旁開1.5寸。其所在平面位于支配胰腺傳入神經(jīng)節(jié)(T5~11神經(jīng)節(jié))的中心。胃脘下俞穴下的第8胸神經(jīng)后支可將電針的痛刺激、電刺激信號經(jīng)脊神經(jīng)前根、脊神經(jīng)和白交通支傳入交感干,終止于交感干神經(jīng)節(jié)。由交感干神經(jīng)節(jié)將電針刺激信號和由其他節(jié)段上行或下行來的神經(jīng)信號整合,發(fā)出到達(dá)胰腺的神經(jīng)叢,調(diào)節(jié)交感神經(jīng)的抑制胰腺分泌的功能[12]。另外一部分電針的痛刺激、電刺激信號經(jīng)脊髓上行至大腦中樞,經(jīng)中樞整合后由迷走神經(jīng)背核發(fā)下行纖維經(jīng)胸、腹腔臟器旁節(jié)或器官內(nèi)節(jié)交換神經(jīng)元,將電針信號輸送至胰腺,調(diào)節(jié)副交感神經(jīng)的促進(jìn)胰腺分泌的功能[12]。按照上述理論,電針“胃脘下俞”對胰腺的形態(tài)和分泌功能理應(yīng)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

    3.2 指標(biāo)選取依據(jù)

    GLP-1由主要分布在小腸末端及大腸的L細(xì)胞合成。L細(xì)胞在受到包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪在內(nèi)的多種營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下分泌GLP-1。GLP-1的受體廣泛分布于下丘腦食欲中樞、胃腸道消化器官、分泌胰島素的胰島B細(xì)胞和接受胰島素的肝、脂肪、骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上。GLP-1能對2型糖尿病產(chǎn)生多方面的正向調(diào)控作用:其可作用于下丘腦食欲中樞,使機(jī)體產(chǎn)生飽腹感,減輕饑餓感;作用于胃,能夠抑制胃酸分泌,減少胃蠕動,延緩胃排空,達(dá)到減少主動進(jìn)食的作用;可作用于胰島A細(xì)胞,使胰高血糖素分泌減少,并作用于胰島B細(xì)胞,促進(jìn)胰島B細(xì)胞增殖,減少胰島B細(xì)胞凋亡,保護(hù)胰島B細(xì)胞的形態(tài)和功能;還可促進(jìn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄,上調(diào)胰島素分泌[13]。且在機(jī)體血糖含量過低時,GLP-1不會發(fā)揮進(jìn)一步的降糖作用。上述作用與針灸療法多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)和雙向良性調(diào)節(jié)的作用方式類似。

    本研究因此認(rèn)為,針灸對2型糖尿病的干預(yù)作用一部分是通過調(diào)節(jié)GLP-1信號通路實(shí)現(xiàn),并提出假說,低頻電針“胃脘下俞”穴可上調(diào)胰腺GLP-1受體含量;借助上調(diào)GLP-1信號通路,達(dá)到保護(hù)胰腺形態(tài)和分泌功能的作用,進(jìn)而改善2型糖尿病大鼠胰腺結(jié)構(gòu)和分泌功能,實(shí)現(xiàn)降血糖的作用。為了驗(yàn)證假說,進(jìn)行如下研究:①取大鼠胰腺檢測GLP-1受體蛋白表達(dá),觀察電針對糖尿病模型動物胰腺中GLP-1通路的激活情況;②以HE染色觀察電針對胰島及胰島B細(xì)胞形態(tài)的修復(fù)情況;③以Masson染色觀察電針對胰島纖維化的改善情況;④以胰島素分泌指數(shù)評估電針對胰島素分泌能力的調(diào)控。結(jié)果初步證實(shí):電針可以促進(jìn)糖尿病模型動物下調(diào)的胰腺GLP-1通路活躍度,在一定程度上改善胰島和胰島B細(xì)胞的形態(tài)受損,逆轉(zhuǎn)胰島纖維化,并通過對胰島形態(tài)學(xué)的修復(fù),恢復(fù)模型動物分泌胰島素的能力,改善2型糖尿病癥狀。

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