低能量激光照射對(duì)脂多糖介導(dǎo)人牙周膜成纖維細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用

靳曉蘭 張亞男 孫成蕊 鄒朝暉

1.天津市津南醫(yī)院口腔科，天津300350；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，天津300192；3.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科三室，天津300070

牙周炎為慢性破壞性疾病，長(zhǎng)期慢性炎性因子浸潤(rùn)導(dǎo)致牙周膜細(xì)胞的損傷和凋亡，使得牙周膠原纖維破壞，嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)會(huì)造成不可逆的牙周損傷導(dǎo)致牙齦萎縮甚至是牙齦壞死。研究[1-2]顯示人牙周膜成纖維細(xì)胞（human periodontal liga‐ment fibroblasts，hPDLFs）在牙周炎受損、牙周組織功能維持和修復(fù)中發(fā)揮著極其重要的作用，有效阻斷牙周炎過(guò)程中hPDLFs 的損傷對(duì)促進(jìn)牙周組織修復(fù)有著重要意義。低能量激光照射（low-lev‐el laser irradiation，LLLI）指的是輸出功率在500 mW內(nèi)，能量密度范圍0.04~50 J·cm-2，波長(zhǎng)范圍600~1 100 nm的近紅外或紅色光激光[3]。LLLI是近年來(lái)臨床上常用的理療方法，其在治療神經(jīng)性和糖尿病潰瘍疾病方面以及促進(jìn)骨組織和軟組織的愈合方面均有較好的作用，其在治療牙周疾病及牙周炎方面亦有顯著療效[4-6]。目前有報(bào)道[7]顯示LLLT可能通過(guò)調(diào)節(jié)腺苷-3’,5’-環(huán)化一磷酸（cyclic ade‐nosine monophosphate， cAMP） /核 轉(zhuǎn) 錄 因 子 -κB（nuclear transcription factor kappa B，NF-κB）抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但是關(guān)于LLLI 對(duì)hPDLFs 炎性損傷的影響和作用有待進(jìn)一步研究，本研究擬探討LLLI對(duì)LPS介導(dǎo)hPDLFs炎性損傷的影響及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

hPDLFs（上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)：2630）。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli） LPS、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-3、MMP-9、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（Sigma公司，美國(guó)），白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），Trizol試劑盒、CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、Western blot 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），相關(guān)引物合成（北京賽百勝生物技術(shù)公司），DMEM 低糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco公司，美國(guó)），CO2培養(yǎng)箱 （Thermo Scientific Forma 公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），F(xiàn)luo-8/AM（Invitrogen 公司，美國(guó)），Insight-PlusIQ 型激光共聚焦顯微鏡（Meridian 公司，美國(guó)），熒光相差顯微鏡（北京榮興光恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLFs 的培養(yǎng) hPDLFs 復(fù)蘇后以 10% FBS的低糖DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d 換液，于熒光相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 分組 將hPDLFs接種于5個(gè)不同培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，隨機(jī)分為正常組、LPS 組、LPS+LLLI 組。正常組細(xì)胞行常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS 組和LPS+LLLI組在加入含1 mg·L-1濃度的LPS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，LPS 組繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)及換液，LPS+LLLI 組3 個(gè)亞組在常規(guī)培養(yǎng)及換液的基礎(chǔ)上分別接受2、4、6 J·cm-2的 LLLI。采 用 輸出 功 率 為 100 mW~12 W 半導(dǎo)體激光器，波長(zhǎng)為980 nm。功率密度設(shè)置為141.5 mW·cm-2，第1 次激光照射，記為第0天，并于第0~3 天連續(xù)照射4 d，4 d 后行后繼檢測(cè)。照射時(shí)間（s）=能量密度（J·cm-2）/功率密度（W·cm-2）。2 J·cm-2組照射時(shí)間為 14.13 s，4 J·cm-2組照 射時(shí) 間為 28.27 s，6 J·cm-2組 照射 時(shí)間 為42.40 s。

1.2.3 CCK-8 測(cè)定細(xì)胞活力值 LLLI 處理后，將5組細(xì)胞取出以測(cè)定每個(gè)組hPDLFs 的細(xì)胞增殖活力。使用PBS 清洗hPDLFs 2 次后，采用完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，以密度為每孔1×104個(gè)接種于96 孔板。隨后向其中加10 μL CCK8試劑，37 ℃下孵育2 h，酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)下的光密度（opti‐caldensity，OD）值，細(xì)胞存活率=（OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100%。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測(cè)定 LLLI 處理后，將 5 組 hPDLFs 經(jīng) PBS 沖洗 2 次，于 37 ℃條件下用終濃度為 10 μmol·L-1Fluo-8/AM 培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞45 min，無(wú)鈣PSS 溶液清洗2 遍，將蓋玻片倒置密封小室上，并向小室中加入500 μL 生理鹽液，經(jīng)過(guò)488 nm 的氫激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，通過(guò)Insight-PlusIQ 型激光共聚焦顯微鏡對(duì)熒光強(qiáng)度行測(cè)定。細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，式中Kd為400 nmol·L-1；F為所測(cè)到的相對(duì)熒光值；Fmax為加入10 μmol·L-1的高鈣液后所得最大熒光值；Fmin為加入 10 μmol·L-1無(wú)鈣液后所得最小熒光值。

1.2.5 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 LLLI處理后，將5組hPDLFs經(jīng)PBS洗2次，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗后，每孔加入0.5 mL 的Hoechst染色液，于溫箱中37 ℃下孵育30 min，PBS 洗去染料后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照，隨機(jī)取5個(gè)視野，正常細(xì)胞核染成均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞胞核碎裂濃縮，呈現(xiàn)明亮藍(lán)色，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 ELISA 測(cè)定細(xì)胞上清液炎性因子 LLLI處理后，采用ELISA 法按說(shuō)明書(shū)測(cè)定每個(gè)實(shí)驗(yàn)組hP‐DLFs 細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 炎性因子含量，經(jīng)離心取各組細(xì)胞上清液為樣品進(jìn)行分析，按相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行上清液中細(xì)胞因子的含量測(cè)定，利用酶標(biāo)儀PR-521 讀取各樣品細(xì)胞OD 值，按照標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對(duì)應(yīng)的OD 值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)確定 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 炎性因子含量。

1.2.7 MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因表達(dá) LLLI處理后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse tran‐scription-polymerase chain reaction，RT-PCR） 測(cè)定5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組 hPDLFs 中 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表達(dá)水平。加入TRIzol 試劑對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行裂解后，提取hPDLFs的總RNA。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)行相應(yīng)cDNA合成并進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件均為95 ℃預(yù)變性 1 min，95 ℃變性 30 s，59 ℃退火30 s，59 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。MMP-2 上游引物序列：5’-TGACTTTCTTGGATCGGGTCG-3’，下游引物序列：5’-AAGCACCACAGATGACTG-3’；MMP-3 上游引物序列：5’-AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT-3’，下游引物序列：5’-TCCCCGT‐CACCTCCAATCC-3’；MMP-9 上游引物序列：5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’，下游引物序列：5’-GGCAGGG ACAGTTGCTTCT-3’；內(nèi)參GAPDH 上游引物序列：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，下游引物序列：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。目的基因灰度值與GAP‐DH 灰度值的比值為MMP-2、MMP-3、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.8 MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白表達(dá) LLLI處理后，通過(guò)Western blot 測(cè)定5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組hPDLFs中MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。提取并定量測(cè)定hPDLFs 總蛋白，將變性后的蛋白進(jìn)行電泳，電泳槽內(nèi)加入足量電泳液，40 V條件下電泳4~5 h，電泳后對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)長(zhǎng)40 min，轉(zhuǎn)膜后用TBST 緩沖液反復(fù)沖洗，置于4 ℃條件下封閉12 h，向其中加入MMP-2、MMP-3、MMP-9 一抗（1∶1 000），加入一抗后進(jìn)行振蕩使其充分接觸，振蕩時(shí)間為1 h，1 h后用上述同樣的沖洗方法沖洗后；加入HRP 標(biāo)記的二抗（1︰1 500）后再次進(jìn)行振蕩使其充分接觸，振蕩1 h并再次沖洗3 次，最后用DAB 顯色法顯影，拍攝X射線(xiàn)膠片，用Image J 圖像分析軟件對(duì)各組條帶行灰度值分析，以GAPDH 作為內(nèi)參。目的蛋白與內(nèi)參灰度比值為MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用K-S 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，多組均數(shù)間的比較采用方差分析，兩兩比較應(yīng)用最小顯著差法（LSD 法）進(jìn)行處理，P<0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLFs細(xì)胞培養(yǎng)

在細(xì)胞接種后24 h，顯微鏡下觀察可見(jiàn)大部分hPDLFs 貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，胞體較為豐滿(mǎn)，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞兩端有較細(xì)長(zhǎng)的突起，3 d換液一次，按1∶2 傳代，經(jīng)過(guò)幾次傳代，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hPDLFs 生長(zhǎng)較為旺盛，免疫熒光顯微鏡下hPDLFs 綠色熒光鑒定波形絲蛋白陽(yáng)性，為中胚層來(lái)源的成纖維細(xì)胞（圖1左）。相差顯微鏡下觀察其排列形狀多為柵欄狀、漩渦狀或放射狀（圖1右）。

圖 1 hPDLFs的鑒定 ×200Fig 1 Identification of hPDLFs ×200

2.2 細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，細(xì)胞活力降低（P<0.05）。與LPS組比較，LPS+LLLI 組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度降低，細(xì)胞活力升高（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI 對(duì)LPS誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷有保護(hù)作用，降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯（表1）。

表 1 細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度Tab 1 Cell survival rate and intracellular calcium ion concentration

2.3 Hoechst染色凋亡率檢測(cè)

與正常組凋亡率（7.8%±2.6%）相比較，LPS組hPDLFs 細(xì)胞凋亡率（46.2%±6.4%）顯著增加（P<0.05）；與LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組細(xì)胞凋亡率（2、4、6 J·cm-2組細(xì)胞凋亡率分別為39.7%±4.8%、 23.1%±3.1%、 31.8%±5.7%） 降 低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI對(duì)LPS誘導(dǎo)hPDLFs炎性損傷有保護(hù)作用，減少細(xì)胞凋亡，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯（P<0.05）（圖2）。

圖 2 Hoechst染色檢測(cè)hPDLFs細(xì)胞凋亡率 熒光顯微鏡 ×200Fig 2 Detection of apoptosis rate of hPDLFs by Hoechst staining fluorescence microscope ×200

2.4 細(xì)胞上清液中炎性因子含量

采用ELISA 法測(cè)定各組細(xì)胞上清液炎性因子含量，與正常組比較，LPS 組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β 及IL-6 的含量顯著升高 （P<0.05）；與LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量顯著降低 （P<0.05），結(jié)果表明，LLLI 能夠降低hPDLFs 炎性損傷后細(xì)胞上清液中的炎性因子，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯（表2）。

2.5 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表達(dá)水平

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因的表達(dá)顯著升高（P<0.05）。與 LPS 組相比較，LPS+LLLI 各亞組 hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因的表達(dá)顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI能夠降低hPDLFs炎性損傷后細(xì)胞MMP-2、MMP-3、MMP-9基因的表達(dá)水平，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯（P<0.05）（圖3）。

表 2 細(xì)胞上清液中炎性因子含量Tab 2 The content of inflammatory factors in cell su‐pernatant μg·L-1，

表 2 細(xì)胞上清液中炎性因子含量Tab 2 The content of inflammatory factors in cell su‐pernatant μg·L-1，

注：與正常組相比，#P<0.05；與LPS 組相比，*P<0.05；與4 J·cm-2組相比，@P<0.05。

IL-6 0.84±0.03*3.36±0.05#2.47±0.04#*@1.38±0.02#*2.35±0.03#*@組別正常組LPS組2 J·cm-2組4 J·cm-2組6 J·cm-2組TNF-α 0.79±0.14*5.27±0.08#3.92±0.05#*@2.82±0.02#*3.48±0.03#*@IL-8 0.92±0.02*6.38±0.06#5.06±0.07#*@3.56±0.04#*5.01±0.06#*@IL-1β 1.03±0.04*7.14±0.06#5.86±0.05#*@3.75±0.06#*5.64±0.03#*@

2.6 MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，LPS 組hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的表達(dá)顯著升高 （P<0.05）。與 LPS 組 相 比 較，LPS+LLLI 各亞 組 hPDLFs 的MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.05）。結(jié)果表明，LLLI能夠降低hPDLFs炎性損傷后細(xì)胞MMP-2、MMP-3、MMP-9 蛋白的表達(dá)，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯（P<0.05）（圖4）。

圖 3 MMP-2、MMP-3、MMP-9基因表達(dá)Fig 3 MMP-2, MMP-3, MMP-9 gene expression

圖 4 MMP-2、MMP-3、MMP-9蛋白表達(dá)Fig 4 MMP-2, MMP-3, MMP-9 protein expression

3 討論

慢性牙周炎是最常見(jiàn)的牙周病，其中牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）在牙周炎時(shí)損傷凋亡是該病理過(guò)程的重要重要環(huán)節(jié)，本研究使用LPS 刺激hPDLFs 可以模擬牙周炎癥反應(yīng)過(guò)程，LPS 選擇1 mg·L-1的濃度，參考國(guó)內(nèi)外參考文獻(xiàn)，和早前的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該濃度正合適能夠引起中度的hPDLFs 炎性損傷，為后繼研究提供炎性損傷模型，雖然加大LPS 濃度，能夠顯著抑制hPDLFs 的存活，但是考慮臨床過(guò)程中慢性牙周炎是輕中度的長(zhǎng)期炎性刺激，故1 mg·L-1的濃度既能導(dǎo)致細(xì)胞炎癥，也沒(méi)有造成細(xì)胞大量死亡，是一個(gè)合理的誘導(dǎo)劑量，但該濃度仍較參考文獻(xiàn)濃度低，考慮與本研究hPDLFs 實(shí)驗(yàn)前液氮存儲(chǔ)凍存復(fù)蘇后進(jìn)行LPS 誘導(dǎo)有關(guān)，凍存復(fù)蘇對(duì)細(xì)胞的狀態(tài)有影響所致，hPDLFs 細(xì)胞對(duì)LPS 誘導(dǎo)損傷敏感性升高[7-9]。結(jié)果顯示LPS 誘導(dǎo)能夠顯著上調(diào)hP‐DLFs 細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量，hPDLFs 細(xì)胞增殖率降低，凋亡增加，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度增加，表明該牙周炎體外細(xì)胞模型成功。在此過(guò)程中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 等炎性因子浸潤(rùn)導(dǎo)致牙周組織細(xì)胞內(nèi)鈣超載，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)中MMP-2、MMP-3、MMP-9的高表達(dá)，MMPs是一類(lèi)含Zn2+的中性蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），MMPs高表達(dá)在牙周炎牙周組織破壞中起著尤為重要的作用[10-12]，本研究LPS 介導(dǎo)炎性損傷后，hP‐DLFs 細(xì)胞 MMP-2、MMP-3、MMP-9 基因和蛋白表達(dá)顯著升高印證了這一點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)LLLI 處理后，LPS 介導(dǎo)的hPDLFs 增殖活性上升且細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度亦顯著降低；據(jù)此可知，LLLI 可以顯著緩解LPS 引起的hPDLFs 炎性損傷。進(jìn)一步采用ELISA 法測(cè)定，與LPS 組比較，LPS+LLLI 組細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 及 IL-6 的含量顯著降低，表明LLLI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷有保護(hù)作用，LLLI 能夠降低hPDLFs 炎性損傷后細(xì)胞上清液中的炎性因子，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯。有研究[12-14]表明，牙周炎患者齦溝液中MMP-2、MMP-3 和MMP-9 的活性增高。此外，隨著牙齦炎癥程度的增加，MMP 活性和表達(dá)也增加，因此，MMP 途徑可能是牙周組織破壞的關(guān)鍵途徑，降低其表達(dá)意義重大。本研究中LLLI 對(duì)LPS 誘導(dǎo)hPDLFs 炎性損傷后細(xì)胞MMP-2、MMP-3 和MMP-9 的表達(dá)檢測(cè)顯示，與LPS 組相比，LPS+LLLI 各亞組 MMP-2、MMP-3 和 MMP-9 顯著降低，照射強(qiáng)度為4 J·cm-2時(shí)效果最明顯，起到了阻斷MMP途徑的作用。

綜上所述，經(jīng)過(guò)LLLI 處理后可顯著改善LPS誘導(dǎo)的hPDLFs 炎性損傷。推測(cè)LLLI 可能是通過(guò)降低細(xì)胞上清液中 TNF-α、IL-8、IL-1β 和 IL-6 的含量進(jìn)而降低hPDLFs 炎性損傷后細(xì)胞MMP-2、MMP-3和MMP-9的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮抗炎作用，本研究結(jié)果可為臨床上采用LLLI 治療牙周炎提供理論依據(jù)和借鑒。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。