骨康靈液在骨折愈合中影像學及組學的研究

王瓊仙，楊騏睿，李成，王金偉，吳春妍，吳林雄

（1 昆明醫(yī)科大學實驗動物學部,云南 昆明；2 云南省骨科醫(yī)院,云南 昆明；3 昆明醫(yī)科大學公衛(wèi)學院,云南 昆明；4昆明醫(yī)科大學藥學院,云南 昆明)

0 引言

骨康靈液是一種院內(nèi)制劑，是由昆明醫(yī)學院科研中試中心研發(fā)，經(jīng)由云南省藥監(jiān)局批準生產(chǎn)。由10 多味中藥經(jīng)炮炙、加工、提取其有效成份后，對其進行一系列的制備，而最終形成的一種藥液，是一種外用藥物[1，2]。骨康靈液經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，在接骨生新方面具有較好的效果，而且對于骨折患者恢復中的骨痂生長具有有效的促進作用，從而更好地幫助骨折患者康復，另外在外傷性閉合骨折及跌打損傷、關(guān)節(jié)紅腫疼痛等疾病中，還可有效發(fā)揮其活血化瘀、消腫止痛的效用。

1 骨康靈液發(fā)揮療效作用的動物實驗研究

1.1 材料與方法

儀器：普通醫(yī)用診斷X 攝線機（本部門實驗室）及手術(shù)器械等。

藥品：本院原制劑室提供，骨康靈液的批準文號為滇藥制字(z)20092434A。

1.2 動物模型的建立與評價

（1）分組：200只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，隨機分為四組。sham 組( 空白對照組),骨折組66只, 對照組( 骨折+95% 酒精組)66只和治療組(骨折+骨康靈液)68只，其中空白對照組均為各組的SD 大鼠股骨左側(cè)，其他3 組均為各組SD 大鼠股骨的右側(cè)，每組多用幾只動物備用。實驗動物購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，實驗動物質(zhì)量合格證號：SYSK(滇)2005-0004，許可證號SCXK(滇)2011-0004。

（2）制備骨折模型：隨機選擇右側(cè)股骨制造股骨中段骨折，利用X 線技術(shù)觀察患肢的具體情況，最后進行傷口的縫合處理(術(shù)后連續(xù)3d 每天按15萬/kg 劑量的青霉素進行肌肉注射，有效預防感染)。

（3）給藥：造模成功后，將藥棉或紗布上浸滿骨康靈液后，將其對治療組的患處進行充分的包纏，并利用小夾板對其進行有效的固定處理，需要注意的是，要保證患處的藥棉經(jīng)常處于比較濕潤的狀態(tài)，每日可間隔6h 定時浸濕藥棉1次，4次/d，從而有效幫助患處的藥物吸收。分別于骨折造模成功給藥后第7、15、21、30、42、50d 各組每次分別大鼠行腹腔麻醉后10只做X-線攝片觀察骨折愈合情況及骨痂生長情況。對照組、治療組骨折給藥后1個月分別各取4只骨折斷端的骨組織放入-80℃冰箱保存，干冰運輸送檢。基因芯片和蛋白質(zhì)譜檢測篩選骨康靈液發(fā)生療效的上下調(diào)基因及目標分子。對照組用西醫(yī)常規(guī)治療（95%酒精）。

1.3 X-線影像評分標準

1分：骨折斷端邊緣呈現(xiàn)出一種趨向性模糊，骨膜輕度反應，無骨痂可見；2分：斷端邊緣模糊，骨膜反應淺淡，骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊；3分：通過觀察可以發(fā)現(xiàn)仍然可以看到接近消失的斷端邊緣，骨膜反應較深，骨痂增加，但缺損未完全填充，密度較深，邊緣呈現(xiàn)出清晰的狀態(tài)；4分：斷端邊緣完全消失，骨膜反應密度與骨影相似，骨痂未填滿缺損，與骨皮質(zhì)密度相同并未相互連接；5分：骨折恢復良好，斷端邊緣完全消失[3-5]。

1.4 統(tǒng)計學分析

以SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。X 線影像評分等為計量資料，對其使用（±s）表示，組間的數(shù)據(jù)對比采用單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組造模后7-50d X 線分析

第7d 時，治療組與對照組影像學無明顯差異，治療組骨折端符合X-線影像評分中1分的標準；第15d 時，治療組有少量骨痂生長，邊緣明顯模糊，而對照組無骨痂生長；第21d 時，治療組骨折斷端骨密度有所增加，骨膜反應漸深，生成較多骨痂，斷端邊緣仍可見，對照組僅有少量骨痂生長；第30d 時，治療組骨密度進一步增加，骨膜反應較深，骨痂量已包繞骨折斷端，但骨折線清晰，對照組出現(xiàn)較多骨痂；第42d 時，治療組骨折線基本消失，骨膜密度接近骨質(zhì)，骨痂填滿骨缺損，骨小梁力學結(jié)構(gòu)漸為合理，對照組骨折線仍清晰，骨痂量較多，骨小梁雜亂；第50d 時X 線攝片，治療組大部分符合5分的標準。結(jié)果:治療組與對照組在造模第7d 的X 影像學無明顯差異(P＞0.05)，在造模50d 時治療組骨痂明顯多于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組造模后7-50d X 線影像評分[（±s）/分]

表1 各組造模后7-50d X 線影像評分[（±s）/分]

組別 n 7d 14d 21d 30d 42d 50d治療組 68 1.67±0.52 2.28±0.39 3.44±0.46 4.00±0.50 4.20±0.30 4.50±0.50對照組 66 1.00±0.55 2.00±0.27 3.00±0.33 3.50±0.11 3.60±0.34 3.70±0.30骨折組 66 0.2±0.11 0.3±0.22 0.4±0.33 0.5±0.39 0.7±0.40 0.9±0.50 sham 組 66 0.1 0.3 0.4 0.5 0.7 0.9

2.2 基因表達譜芯片實驗

動物SD 大鼠治療組4只（骨折+骨康靈液，2 雌，2 雄，樣品編號A、B、C、D）；對照組4只（骨折，2 雌，2 雄，樣品編號E、F、G、H）。表2 中可見，篩選出上調(diào)基因650個，下調(diào)基因157個，差異基因總數(shù)807個。A vs E 比較，篩選出上調(diào)基因2149個，下調(diào)基因1418個，差異基因總數(shù)3567個，其他的依此類推。

表2 兩組差異基因統(tǒng)計比較

3 討論

骨折愈合是一個相對較為復雜的過程，是骨折斷端間的一種組織修復反應，在這個過程中，有較多的細胞及細胞因子參與其中，并起到協(xié)調(diào)的作用。而且該過程的實質(zhì)是骨細胞的再生以及骨折的完全修復，局部骨生長因子在其中起著重要的調(diào)控作用，其對于愈合速度和質(zhì)量意義重大[6-10]，但最終的目標是恢復骨骼的正常結(jié)構(gòu)和功能。如何促進骨折愈合一直是醫(yī)學領(lǐng)域的重要課題，中醫(yī)藥促進骨折愈合也是中醫(yī)骨傷學的一個重要研究方向。

在本研究中，治療組與對照組相比，在造模第7d X 影像學無明顯差異(P＞0.05)，在造模50 天治療組骨痂明顯多于對照組(P＜0.05)。骨康靈液制劑可促使骨痂生長，骨康靈液對骨折愈合有修復作用[11,12]；基因芯片檢測篩選上下調(diào)基因結(jié)果已經(jīng)篩選出來了，而目標基因和分子的篩選檢測實驗還在準備中。有待于下一步進一步研究骨康靈液制劑發(fā)生療效作用的愈合機制。