血塞通聯(lián)合丙泊酚治療創(chuàng)傷性腦損傷療效及作用機制研究

王瓊仙，吳春妍，王利梅，李進濤，張?zhí)m春，鄭紅，曹雪，楊騏睿，李成，吳林雄△

（1 昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，云南 昆明；2 昆明醫(yī)科大學公衛(wèi)學院，云南 昆明；3 昆明醫(yī)科大學藥學院；云南 昆明)

0 引言

血塞通的主要有效成分是三七總皂苷[1]。功能主治是活血祛瘀，通脈活絡，抑制血小板聚集和增加腦血流量，具有止血、鎮(zhèn)痛、散瘀、活血消腫等作用。丙泊酚化學名為2,6-雙異丙基苯酚，是目前臨床上普遍用于麻醉誘導、麻醉維持、ICU 危重病人鎮(zhèn)靜的一種新型快速、短效靜脈麻醉藥[2]。本項目是在復習大量文獻基礎上擬調(diào)查血塞通聯(lián)合丙泊酚對腦的治療效果，是否是通過上調(diào)BDNF 及其受體TrkB 和下游信號分子來實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 動物的分組

140只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，隨機分為四組。正常組（假手術組 A 組），TBI+脂肪乳組（腦損傷組 B 組），TBI+丙泊酚組（丙泊酚治療腦損傷組 C 組），TBI+丙泊酚+血塞通組（血塞通聯(lián)合丙泊酚治療腦損傷組 D 組）。實驗動物購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，實驗動物質(zhì)量合格證號：SYSK(滇)2005-0004，許可證號SCXK(滇)2011-0004。

1.2 動物模型建立與藥物治療

采用改良的Feeney 氏法自由落體撞擊制作腦外傷模型[3]。用3.6%水合氯醛(1ml/100g)進行腹腔注射麻醉。麻醉完全后,將大鼠俯臥位固定，常規(guī)消毒鋪巾,在頭距前囟5mm 處冠狀切開皮膚成“V”或“U”型切口, 將頭皮向尾側翻開。分離骨膜,暴露右側頂骨,于矢狀縫旁開2.5mm,冠狀縫后1.5mm 鉆一骨孔,咬除顱骨直至骨窗擴大為直徑5.0mm×5.0mm,顯露硬腦膜，注意保護矢狀竇和硬腦膜。將潔凈的墊片輕輕地置于骨窗中央，以50g 重的鐵質(zhì)圓柱體自30cm 高處沿鐵桿自由落體撞擊墊片,造成右側大腦運動皮質(zhì)區(qū)挫裂傷。假手術僅咬除顱骨，不進行砸傷，飼養(yǎng)護理同手術組。術后前3型每日給腦外傷大鼠腹腔注射頭孢8萬單位預防感染，術后2 周內(nèi)每日早晨8點給予藥物治療，劑量及給藥方式如下：丙泊酚20mg/kg，腹腔注射。血塞通50mg/kg。

1.3 行為學評價

1.3.1 大鼠的神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity score，NSS）

分別于損傷后1d、3d 和7d 進行神經(jīng)功能雙盲法評分，三個經(jīng)過培訓熟練掌握評分標準的人進行評分，取平均值進行統(tǒng)計學評分，每天評分時間固定在早上8：00。

1.3.2 電生理CSEP 皮層體感誘發(fā)電位檢測

將大鼠頭部固定于腦立體定位儀平臺,剪去顱頂毛,在前囪部位沿中線切開皮膚1.5cm,鈍性分離,充分暴露顱骨,清楚地暴露顱骨骨縫,在冠狀縫后緣1-2mm、矢狀縫旁開2-3mm,手持電鉆,用2.5mm 球形牙科鉆緩緩鉆磨顱骨,要求恰好鉆到出現(xiàn)白色的、略帶透明的骨皮質(zhì),然后用眼科鑷,輕輕挑起殘余的骨皮質(zhì),并小心剝離,即可暴露出完好的硬腦膜[4]。然后將銀球引導電極用萬向夾固定于鉆孔處,相當于皮層感覺運動區(qū)(額頂區(qū))，隨后將2個注射針頭分別插入大鼠對側前爪腕部的兩側皮膚,刺激輸出的2個電極(注意2個電極不能相觸)，分別連接2個注射針頭,開始刺激并觀察誘發(fā)電位的變化。

1.4 樣本獲取

NSS 評分及電生理檢測結束后，開始灌注固定取材，用于形態(tài)學研究；每組15只。材料放入4%多甲固定過夜，其它動物模型，分別治療后3d、7d，進行新鮮樣本取材；首先每個時間點10只/組，獲得腦組織，入-80℃冰箱備用。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NSS 評分

NSS 評分結果見圖1。

圖1 各組間所得神經(jīng)損傷程度評分

血塞通聯(lián)合丙泊酚治療腦外傷中TrKB mRNA 的表達變化：

與3d 時相比，TrKB mRNA 的表達水平在血塞通和丙泊酚聯(lián)合治療7d 后明顯降低（P≈0.00＜0.01）。術后1d，脂肪乳組的TrKB mRNA 的表達明顯降低（P≈0.00＜0.01），給予丙泊酚處理后，又顯著逆轉了這一降低（P≈0.00＜0.01）；同樣的損傷后3dTrKB mRNA 的表達水平也被明顯降低（P≈0.00＜0.01），給予丙泊酚處理后其表達較TBI+fat 組明顯進一步降低（P=0.0008＜0.01），然而在血塞通聯(lián)合丙泊酚治療組中TrKB mRNA 的表達水平明顯又高于TBI+pro 組（P≈0.00＜0.01）；在術后7d 時，損傷組的TrKB mRNA 的表達量明顯高于Sham 組，各組間的變化趨勢大體與術后3d 相同，損傷后TrKB mRNA 的表達較Sham 組明顯升高（P=0.00000006＜0.01），而丙泊酚治療后則顯著低于TBI+fat 組的（P≈0.00＜0.01），同時在接受血塞通聯(lián)合丙泊酚治療后，TrKB mRNA 的表達更進一步降低（P≈0.00＜0.01）。

2.2 電生理CSEP 皮層體感誘發(fā)電位結果

血塞通+丙泊酚+TBI 治療后與治療前比較，潛伏期縮短，波幅降低，說明SD 大鼠腦損傷后腦部通路受到一定的損傷[5]。P=0.000 ＜0.01，有顯著統(tǒng)計學差異。

3 討論

本實驗通過建立TBI 大鼠模型，用血塞通聯(lián)合丙泊酚治療后與治療前比較，通過行為學評價結果顯示：血塞通+丙泊酚+TBI 治療后與治療前比較，從NSS 評分結果我們發(fā)現(xiàn)單純丙泊酚組，血塞通聯(lián)合丙泊酚組對TBI 損傷都有治療作用，但通過比較發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組展現(xiàn)出更好的治療效果；而從CSEP 電生理檢測結果我們可以看出TBI 損傷后的確對大鼠的神經(jīng)傳導功能造成了抑制性的作用[6,7]，經(jīng)過治療后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組能夠讓神經(jīng)傳導功能有一個更好的恢復作用。同時經(jīng)過使用聯(lián)合用藥后丙泊酚TBI組應有的炎癥細胞因子合成釋放被抑制的現(xiàn)象消失了，出現(xiàn)了降低后的一個BDNF 升高表達的上調(diào)，從而影響其受體TrkB 升高而上調(diào)[8,9]。

綜上所述，本課題血塞通治療TBI 的過程中，對丙泊酚的抗損傷作用，是通過上調(diào)BDNF 及其受體TrkB 來實現(xiàn)的，加入血塞通治療TrKB 明顯升高，證明血塞通治療TBI 不僅上調(diào)了BDNF，同時也上調(diào)了它的受體TrKB,只有兩者同時上調(diào)，才能完美結合，發(fā)揮BDNF 的生物學神經(jīng)營養(yǎng)的作用[10-12]。