miR-15b-5p靶向CRKL基因?qū)θ毖?復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和增殖的作用機(jī)制

黃糧 吳瑞霞 王嵐 肖杰 成忠

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430030)

急性心肌梗死(AMI)具有較高的發(fā)病率，且已嚴(yán)重威脅人類生命安全，目前臨床主要采用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入及溶栓等方法治療AMI以避免心肌缺血缺氧，但缺血心肌恢復(fù)血液供應(yīng)后又可誘發(fā)心肌缺血再灌注損傷〔1〕。因此，如何有效阻止缺血再灌注所致心肌損害及減少心肌細(xì)胞凋亡成為AMI治療過程中的首要問題。研究表明缺氧/復(fù)氧(H/R)誘導(dǎo)的心肌損傷、心力衰竭等疾病的重要發(fā)病機(jī)制主要為心肌細(xì)胞凋亡增加及活性降低〔2〕。探究H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制對(duì)改善患者心臟功能及降低死亡率均具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，并可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞分化及凋亡的生物學(xué)過程〔3〕。微小RNA-15b-5p(miR-15b-5p)在胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，并可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕。Liu等〔5〕研究表明，通過抑制大鼠中miR-15b-5p表達(dá)可預(yù)防大鼠腦缺血/再灌注損傷，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出CRKL是miR-15b-5p的靶基因，張志升等〔6〕研究表明沉默CRKL可促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并降低心肌細(xì)胞生存率，但關(guān)于其如何調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡及增殖尚未完全清楚。本研究通過敲低miR-15b-5p表達(dá)并進(jìn)行H/R干預(yù)探討抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡及增殖的影響及其對(duì)CRKL基因的調(diào)控作用，擬揭示H/R誘導(dǎo)的心肌損傷等發(fā)病機(jī)制，為防治AMI等心臟疾病再灌注損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1及空質(zhì)粒均購(gòu)自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-15b-5p mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-15b-5p抑制劑(anti-miR-15b-5p)、anti-miR-NC及轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；CRKL siRNA(si-CRKL)與陰性對(duì)照siRNA(si-NC)均購(gòu)自美國(guó)CST公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TakaRa公司；小鼠抗人CRKL抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物研究所；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；野生型及突變型CRKL基因3′UTR熒光素酶表達(dá)載體均購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海艾躍生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 大鼠H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至60%時(shí)更換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，分別將miR-15b-5p抑制劑(anti-miR-15b-5p)、anti-miR-NC瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞，將H9C2心肌細(xì)胞分為Con組(不進(jìn)行任何處理的心肌細(xì)胞)、anti-miR-15b-5p組、anti-miR-NC組。分別將pcDNA-CRKL轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞，將H9C2心肌細(xì)胞分為pcDNA組、pcDNA-CRKL組。后續(xù)研究中將anti-miR-NC及anti-miR-15b-5p轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞以此驗(yàn)證miR-15b-5p是否靶向調(diào)控CRKL表達(dá)。分別將si-NC、si-CRKL與anti-15b-5p共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，將H9C2細(xì)胞分為anti-15b-5p+si-NC組、anti-15b-5p+si-CRKL組。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)8 h，將培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，每組細(xì)胞均備2份，一份細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組H9C2心肌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3構(gòu)建H/R心肌細(xì)胞模型 制備缺氧培養(yǎng)基：采用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，其與氮?dú)饧癈O2充分飽和，時(shí)間超過3 h。制備復(fù)氧培養(yǎng)基：取含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，置于室溫常氧培養(yǎng)箱，時(shí)間超過3 h。取出另一份轉(zhuǎn)染24 h后及未經(jīng)任何處理的H9C2心肌細(xì)胞，加入缺氧培養(yǎng)基并置于低氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)(缺氧模型)，24 h后取出培養(yǎng)瓶，胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，吸取上清，加入復(fù)氧培養(yǎng)基，放入常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞(復(fù)氧模型)，培養(yǎng)1 h后檢測(cè)細(xì)胞凋亡〔7〕。

1.4qRT-PCR檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞中miR-15b-5p及CRKL mRNA表達(dá) 利用Trizol試劑提取H9C2心肌細(xì)胞RNA，將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照qRT-PCR試劑盒說明書配置體系，置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)miR-15b-5p及CRKL mRNA相對(duì)表達(dá)量，PCR擴(kuò)增條件為95℃ 5 min循環(huán)1次，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)40次。miR-15b-5p以U6為內(nèi)參基因，CRKL以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-15b-5p及CRKL mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5Western印跡檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞中CRKL蛋白表達(dá) 分別取各組H9C2心肌細(xì)胞置于EP試管中，分別加入蛋白裂解液經(jīng)離心后提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，使用半干法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封膜2 h，TBST洗膜，加入CRKL抗體過夜(4℃)，加入二抗，室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色，利用X線膠片顯影定影，并采用Imageproplus6.0圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞凋亡 應(yīng)用膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2心肌細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(密度1×108/L)，0.25%胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形時(shí)加入DMEM培養(yǎng)基(含有10%FBS)終止消化，置于離心機(jī)離心，棄上清，重懸細(xì)胞，分別加入10 ml Annexin V 后室溫下孵育，15 min后使用200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7MTT檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞增殖活性 用MTT法檢測(cè)H9C2心肌細(xì)胞增殖活性，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)加入20 μl、5 mg/ml的MTT溶液，室溫孵育4 h，棄培養(yǎng)液后分別在每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后溶解結(jié)晶物，置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為490 nm處光密度(OD)值，OD值大小即細(xì)胞增殖能力。

1.8雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用NCBI下載CRKL的3′UTR序列并利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，收回純化的擴(kuò)增片段，構(gòu)建WT-CRKL、MUT-CRKL載體，轉(zhuǎn)染前收集H9C2心肌細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將miR-15b-5p mimic與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞，含有10% FBS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h，更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染2 h后收集細(xì)胞裂解液，根據(jù)熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書操作，利用生物發(fā)光儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H/R處理對(duì)心肌細(xì)胞中miR-15b-5p和CRKL表達(dá)的影響 相比于Con組(0.97±0.08、1.02±0.09、0.57±0.06)，H/R組H9C2心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)(2.73±0.18)顯著升高，CRKL mRNA及蛋白表達(dá)(0.47±0.08、0.22±0.04)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 H/R處理對(duì)心肌細(xì)胞中CRKL 蛋白表達(dá)的影響

2.2抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示H/R+anti-miR-15b-5p組H9C2心肌細(xì)胞中miR-15b-5p表達(dá)(1.14±0.11)顯著低于H/R+anti-miR-NC組(2.77±0.21，P<0.05)，提示抑制miR-15b-5p表達(dá)細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率較高；Con組(1.00±0.08)顯著低于H/R組(2.81±0.16)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與Con組〔(7.69±0.81)%〕相比，H/R組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率〔(21.47±2.06)%〕明顯升高(P<0.05)。與H/R+anti-miR-NC組〔(23.46±2.17)%〕相比，H/R+anti-miR-15b-5p組細(xì)胞凋亡率〔(14.28±1.39)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 細(xì)胞凋亡流式圖

2.3抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R處理心肌細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H/R組心肌細(xì)胞OD值顯著低于Con組(P<0.05)，H/R+anti-miR-15b-5p組顯著高于H/R+anti-miR-NC組(P<0.05)，見圖3。

與Con組比較：1)P<0.05；與H/R+anti-miR-NC組比較：2)P<0.05圖3 各組心肌細(xì)胞增殖比較

2.4過表達(dá)CRKL對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和增殖的影響 通過構(gòu)建CRKL過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后構(gòu)建H/R模型，Western印跡驗(yàn)證CRKL過表達(dá)轉(zhuǎn)染效率，H/R+pcDNA-CRKL組H9C2心肌細(xì)胞中CRKL蛋白表達(dá)(0.47±0.03)顯著高于H/R+pcDNA組(0.24±0.02，P<0.05)，H/R組(0.26±0.03)顯著低于Con組(0.61±0.05)，表明CRKL過表達(dá)轉(zhuǎn)染成功。流式細(xì)胞術(shù)及MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H/R組H9C2心臟細(xì)胞凋亡率〔(24.57±2.35)%〕顯著高于Con組〔(8.13±0.84)%〕，H/R+pcDNA-CRKL組〔(15.47±1.38)%〕相較于H/R+pcDNA組〔(26.79±2.17)%〕明顯降低(P<0.05)，而H9C2心肌細(xì)胞增殖活性顯著高于H/R+pcDNA組(P<0.05)。見圖4，圖5。

1～4：Con組、H/R組、H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-CRKL組圖4 CRKL蛋白表達(dá)

與Con組比較:1)P<0.05；與H/R+pcDNA組比較:2)P<0.05圖5 過表達(dá)CRKL對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖的影響

2.5miR-15b-5p靶向調(diào)控CRKL的表達(dá) 采用microRNA.Org等靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p與CRKL存在靶向作用，分別轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic、miR-NC與WT-CRKL、MUT-CRKL的熒光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)入心肌細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic后，相對(duì)于miR-NC組(1.02±0.08)，攜帶有WT-CRKL報(bào)告基因載體的心肌細(xì)胞熒光素酶活性明顯降低(0.39±0.04，P<0.05)，而攜帶有MUT-CRKL報(bào)告基因載體的心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-15b-5p mimic后熒光素酶活性無(wú)明顯變化(0.99±0.07、1.01±0.09，P>0.05)。Western印跡進(jìn)一步驗(yàn)證miR-15b-5p與CRKL的靶向調(diào)控關(guān)系，結(jié)果顯示miR-15b-5p組H9C2心肌細(xì)胞中CRKL蛋白表達(dá)(0.24±0.03)明顯低于miR-NC組(0.59±0.05，P<0.05)，anti-miR-15b-5p組(0.87±0.07)明顯高于anti-miR-NC組(0.57±0.06，P<0.05)，見圖6，圖7。

圖6 CRKL 3′UTR中與miR-15b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

1～4：miR-NC組、miR-15b-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-15b-5p組圖7 miR-15b-5p調(diào)控CRKL蛋白的表達(dá)

2.6抑制CRKL表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和增殖的作用 分別共轉(zhuǎn)染si-NC、si-CRKL與anti-15b-5p進(jìn)入H/R誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞，Western印跡結(jié)果顯示H/R+anti-15b-5p+si-CRKL組CRKL蛋白表達(dá)(0.42±0.04)明顯低于H/R+anti-15b-5p+si-NC組(0.74±0.06,P<0.05)，H/R+anti-miR-156-5p組(0.72±0.07)明顯高于H/R+anti-miR-NC組(0.21±0.03)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示H/R+anti-miR-15b-5p組H9C2心肌細(xì)胞凋亡率〔(12.57±1.14)%〕明顯低于H/R+anti-miR-NC組〔(22.76±2.11)%〕，H/R+anti-15b-5p+si-CRKL組〔(17.69±1.73)%〕相較于H/R+anti-15b-5p+si-NC組〔(10.78±1.34)%〕明顯升高(P<0.05)，而心肌細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05)，見圖8，圖9。

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-15b-5p組、anti-miR-15b-5p+si-NC組、anti-miR-15b-5p+si-CRKL組圖8 CRKL蛋白表達(dá)

與H/R+anti-miR-NC組比較:1)P<0.05；與H/R+anti-15b-5p+si-NC組比較:2)P<0.05圖9 抑制CRKL表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)增殖的促進(jìn)作用

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷可引發(fā)心律失常及心肌梗死等狀況，研究顯示缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平升高，并可促使心肌細(xì)胞凋亡〔8，9〕。因此減少缺血再灌注損傷誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡可有效保護(hù)AMI患者心肌。部分miRNA異常表達(dá)可能在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用〔10〕。因此本研究進(jìn)一步探究miRNA對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和增殖的作用機(jī)制，可為心血管疾病治療提供新靶點(diǎn)。

miR-15b-5p具有多種生物學(xué)功能并可調(diào)控子宮肌瘤等不同腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡過程〔11〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-15b可調(diào)節(jié)血管生成、心肌缺血再灌注損傷及細(xì)胞凋亡等過程，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-15b在缺血再灌注損傷小鼠模型的心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)，并可抑制Bcl-2表達(dá)進(jìn)而促使細(xì)胞凋亡〔12，13〕。miR-15b-5p異常表達(dá)與冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)〔14～16〕。由此推測(cè)miR-15b-5p可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果說明H/R處理后心肌細(xì)胞中miR-15b-5p呈高表達(dá)。本研究通過抑制miR-15b-5p表達(dá)并進(jìn)行H/R處理，結(jié)果說明抑制miR-15b-5p表達(dá)可增強(qiáng)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖能力并降低心肌細(xì)胞凋亡率。提示心肌細(xì)胞H/R損傷可能與miR-15b-5p表達(dá)水平升高有關(guān)，抑制miR-15b-5p表達(dá)可能對(duì)心肌細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用。

腫瘤抑制因子SASH1可與CRKL相互作用進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，研究發(fā)現(xiàn)miR-1827可靶向調(diào)節(jié)CRKL表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)肺腺癌腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及血管生成過程〔17，18〕。H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中CRKL蛋白表達(dá)明顯降低，通過采用shRNA敲低CRKL基因表達(dá)可能通過降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡〔19，20〕。本研究結(jié)果說明CRKL蛋白表達(dá)水平降低可加重H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。通過構(gòu)建CRKL過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至H9C2心肌細(xì)胞行H/R處理，結(jié)果說明CRKL過表達(dá)可減少H/R引起的心肌細(xì)胞損傷并可能改善患者心臟功能。提示上調(diào)CRKL表達(dá)水平可能減輕H/R誘發(fā)的組織器官損傷。本研究證實(shí)miR-15b-5p高表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)miR-15b-5p與CRKL可能存在靶向作用，進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-15b-5p可靶向調(diào)控CRKL基因表達(dá)，提示miR-15b-5p可能通過下調(diào)CRKL基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。本研究轉(zhuǎn)染CRKL siRNA沉默CRKL表達(dá)，結(jié)果說明抑制CRKL表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-15b-5p表達(dá)對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和增殖的作用。提示miR-15b-5p可直接靶向調(diào)控CRKL表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并降低細(xì)胞增殖能力。由此可知，H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷過程中CRKL蛋白表達(dá)降低，miR-15b-5p高表達(dá)并可降低CRKL蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-15b-5p在H/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，抑制miR-15b-5p可減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞增殖，而miR-15b-5p可能是通過負(fù)向調(diào)控CRKL而發(fā)揮作用，miR-15b-5p可能成為臨床診斷及治療AMI的重要靶點(diǎn)基因。但關(guān)于miR-15b-5p與CRKL是如何調(diào)控H/R損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及其可能作用通路均需深入研究。