清肺理痰方對COPD模型大鼠呼吸功能的影響及其機制

朱漢平 王鵬 李振球 潘俊輝 謝栩碩 劉小虹 張曉蕓

(1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科；3廣州市中醫(yī)院中醫(yī)科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是以不完全可逆的氣流受限為特征的一種慢性疾病狀態(tài)〔1〕。在全世界范圍內(nèi)COPD的發(fā)病率和死亡率仍然呈逐年增加的趨勢，預(yù)計至2020年將上升為世界三大致死病因之一〔2〕。COPD是以呼吸系統(tǒng)慢性炎癥為主要特征，炎癥細胞浸潤可導(dǎo)致黏液分泌增加，而黏液分泌增加又導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，與COPD進展密切相關(guān)〔3〕。清肺理痰方是在痰熱壅肺證型的方藥基礎(chǔ)上衍生而成，具有清熱化痰、宣肺止咳的功效，最初在臨床上用于肺炎喘嗽并取得顯著療效，臨床實踐發(fā)現(xiàn)清肺理痰方對COPD也具有較好的臨床療效，但是具體機制尚不明確。本文探討清肺理痰方對COPD大鼠的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1動物 SD大鼠共50只，SPF級，雄性，6～8周齡，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXK(粵)2013-0034。實驗開始前先適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，給予標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動物飼料，整個實驗中大鼠自由飲水和進食。

1.1.2主要試劑及藥品 水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司)，脂多糖(美國Sigma公司)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒和Lysis Buffer裂解液(上海碧云天公司)，白細胞介素(IL)-8檢測試劑盒和腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，Trizol 總 RNA 提取試劑盒、Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)試劑〔天根生化科技(北京)有限公司〕，Affymetrix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、Janus激酶(JAK)-1和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)-3及內(nèi)參β-actin引物設(shè)計與合成由天根生化科技(北京)有限公司完成。清肺理痰方(石膏 30 g，魚腥草 20 g，瓜蔞皮、黃芩、浙貝母、蘆葦莖、桔梗各 15 g，青天葵、北杏仁、甘草各10 g)：取藥材浸泡2 h，加10倍量水煎煮2 h過濾，再加8倍量水煎煮2 h，過濾混合兩次濾液，濃縮后4℃保存(每1 ml含生藥4 g)，分裝滅菌，冷藏備用。臨用前等倍稀釋。

1.1.3主要儀器 口鼻式吸入暴露染毒系統(tǒng)、香煙煙霧發(fā)生器(柴田科學(xué)株式會社)，Buxco動物肺功能分析系統(tǒng)(北京華運安特科技有限責(zé)任公司)，紫外可見分光光度儀(德國Eppendorf公司)，ABI step one熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，GeneGenius全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)。

1.2實驗方法

1.2.1分組與造模 所有大鼠隨機分為5組，每組10只。各組大鼠于實驗第1、14天腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉。正常對照組大鼠用靜脈套管針在氣管內(nèi)注入200 μl生理鹽水。其他組大鼠在氣管內(nèi)注入脂多糖(200 μg/200 μl)，以軸位旋轉(zhuǎn)大鼠數(shù)次，并且早晨在口鼻式吸入暴露染毒系統(tǒng)內(nèi)持續(xù)熏吸香煙煙霧30 min。

1.2.2給藥方法 清肺理痰方大、中、小劑量組于實驗第2～13天，第15～30天分別灌胃給予8 g/kg、4 g/kg和2 g/kg清肺理痰方藥液，正常對照組和模型對照組大鼠分別灌胃給予同體積的純凈水。5組大鼠的療程均為4 w。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1肺功能的測定 實驗最后1 d各組大鼠灌胃后1 h腹腔注射2 %戊巴比妥鈉進行麻醉，氣管插管后采用肺功能檢查儀器測定用力肺活量(FVC)，0.3 s用力呼氣容積(FEV0.3)和最大呼氣流量(PEF)，計算FEV0.3/FVC。

1.3.2血清IL-8和TNF-α的測定 各組大鼠腹主靜脈取血2 ml，室溫下靜止30 min，離心，分離得血清。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定IL-8和TNF-α水平。測定過程嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.3.3肺組織MDA和SOD含量的測定 取各組大鼠雙肺于-80℃冰箱中保存。取左肺加生理鹽水制備10%組織勻漿，離心，分離得上清液。采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，采用分光光度法測定組織中MDA、SOD 含量。測定過程嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.3.4肺組織MMP-9、TIMP-1、JAK-1和STAT-3 mRNA的測定 取右肺組織在液氮中研磨后加Trizol試劑提取總RNA。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min。純化cDNA后進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：1 μl cDNA 模板，目標(biāo)基因上游引物和下游引物各1 μl，10 μl Super Real Pre Mix Plus，7 μl H2O。各引物序列如下：MMP(5′-GAT CCC CAG AGC GTT ACT CG-3′，5′-GTT GTG GAA ACT CAC ACG CC-3′)，TIMP-1(5′-ACG CTA GAG CAG ATA CCA CG-3′，5′-GCC CTT ATA ACC AGG TCC GAG-3′)，JAK-1(5′-ATG GAG TTT CTG CCT TCG GG-3′，5′-CTC CGG AGC GTA CCA AAA CA-3′)，STAT-3(5′-AAA GTA TTG TCG CCC CGA GA-3′，5′-CAG GTC GTT GGT GTC ACA CAG-3′)和GAPDH(5′- CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC TC-3′，5′- TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 s，然后以95 ℃ 30 s、60℃ 60 s，37 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計算目標(biāo)基因的相對表達量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進行F檢驗，單因素方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺功能比較 模型對照組大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均較正常對照組顯著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大劑量組FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF均較模型對照組顯著升高(P<0.05)，清肺理痰方可劑量依賴性升高COPD大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC和PEF水平(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血清IL-8、TNF-α、肺組織MDA、SOD水平比較 模型對照組大鼠血清IL-8、TNF-α、腫組織MDA均較正常對照組顯著升高，SOD顯著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大劑量組血清IL-8、TNF-α、肺組織MDA均較模型對照組顯著降低，SOD顯著升高(P<0.05)，清肺理痰方可劑量依賴性降低COPD大鼠血清IL-8、TNF-α、肺組織MDA水平，升高SOD水平(P<0.05)。見表2。

組別IL-8(ng/L)TNF-α(ng/L)MDA(mmol/mg)SOD(U/mg)正常對照組198.35±13.49259.29±18.6136.47±3.65216.81±19.64模型對照組367.13±24.651)386.38±21.291)78.81±8.761)89.46±9.871)清肺理痰方小劑量組355.45±25.31379.25±23.8775.23±8.4993.25±11.25清肺理痰方中劑量組297.36±22.842)3)321.57±21.852)3)61.27±8.152)3)119.38±14.892)3)清肺理痰方大劑量組253.68±17.492)3)4)289.86±19.692)3)4)49.75±7.472)3)4)154.67±16.842)3)4)F/P值110.227/<0.00168.523/<0.00154.755/<0.001124.891/<0.001

2.3各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1、JAK-1和STAT-3 mRNA比較 模型對照組大鼠肺組織MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA均較正常對照組顯著升高，TIMP-1 mRNA較正常對照組顯著降低(P<0.05)。清肺理痰方中、大劑量組肺組織MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA較模型對照組顯著降低(P<0.05)，TIMP-1 mRNA顯著升高(P<0.05)；清肺理痰方可劑量依賴性降低COPD大鼠肺組織MMP-9、JAK-1和STAT-3 mRNA水平，升高TIMP-1 mRNA水平(P<0.05)。見表3、圖1。

1～5：正常對照組、模型對照組、清肺理痰方小劑量組、清肺理痰方中劑量組、清肺理痰方大劑量組圖1 PCR凝膠電泳

3 討 論

COPD屬于中醫(yī)學(xué)的肺脹、喘病和咳嗽等以肺臟病變?yōu)橹鞯姆蜗导膊》懂?。COPD因感受風(fēng)熱或痰郁化熱，遷延失治，耗傷氣陰，痰瘀互阻。清肺理痰方具有清熱宣肺、化痰散瘀、益氣潤肺的功效，適用于COPD，痰熱瘀阻之證候〔4〕。本研究結(jié)果提示清肺理痰方可顯著改善COPD大鼠的肺功能。

目前認為COPD的發(fā)病機制主要集中在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶/抗蛋白酶失衡等方面〔5〕。COPD以慢性炎癥為主要特征，發(fā)生發(fā)展與炎癥密切相關(guān)。TNF-α與IL-8共同參與COPD的炎癥反應(yīng)，TNF-α具有多種前炎性介質(zhì)的功能，主要參與氣道炎癥形成時中性粒細胞活化，加重炎癥癥狀使氣道結(jié)構(gòu)重塑，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)破壞〔6〕。IL-8是一種重要的炎癥介質(zhì)，可參與中性粒細胞和淋巴細胞的聚集與活化，并可導(dǎo)致IL-8的進一步釋放〔7〕。本研究結(jié)果說明清肺理痰方可降低COPD大鼠血液IL-8和TNF-α。

氧化應(yīng)激是COPD的核心發(fā)病機制之一，正常情況下肺內(nèi)細胞通過抗氧化系統(tǒng)的作用保持氧化/抗氧化平衡。長期暴露于有害顆?；驓怏w時COPD患者機體氧化能力和抗氧化能力的平衡被打破〔8〕。目前認為細胞毒性產(chǎn)物 MDA 可以反映 COPD組織細胞氧化損傷程度，SOD 則是重要的抗氧化酶，其活性也反映出細胞氧化應(yīng)激的受損程度〔9〕。本研究結(jié)果說明清肺理痰方可降低COPD大鼠肺組織MDA并升高SOD。

近年來研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路參與細胞增殖、分化。JAK激酶是一種非受體型酪氨酸激酶，STAT是JAK下游的轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，體內(nèi)部分細胞因子由胞膜向核內(nèi)進行信號傳遞，與STAT受體結(jié)合后可激活信號通路〔10〕。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在COPD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用。激活JAK/STAT信號通路后可介導(dǎo)炎性細胞因子積聚，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生和發(fā)展，產(chǎn)生一系列的臨床癥狀〔11〕。本研究結(jié)果說明清肺理痰方可調(diào)節(jié)慢性阻塞性肺疾病證大鼠肺組織JAK1/STAT3通路。

MMPs與TIMPs參與調(diào)節(jié)組織炎癥的過程，MMPs和TIMP的表達失衡可導(dǎo)致細胞外基質(zhì)沉積癥退化，導(dǎo)致氣道損傷及肺氣腫〔12〕。MMP-9 是 MMPs 家族中的一員，TIMP-1 是 MMP-9 的內(nèi)源性抑制劑，TIMP-1是 MMP-9的體內(nèi)抑制劑，通過抑制MMP-9活性降低MMP-9破壞基質(zhì)程度〔13〕。因此，MMP-9及TIMP-1的濃度變化與氣道炎癥損傷有關(guān)。本研究結(jié)果說明清肺理痰方可調(diào)節(jié)COPD大鼠肺組織MMP9/TIMP1 mRNA表達。