• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于p63MAPK探究抵當(dāng)湯對(duì)急性出血性腦卒中大鼠凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2/Caspase3表達(dá)的影響

    2021-06-09 07:45:50肖瑤任吉祥馮麗娜蘭天野黎明全
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:湯高腦組織神經(jīng)功能

    肖瑤 任吉祥 馮麗娜 蘭天野 黎明全

    (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130117;2附屬醫(yī)院;3中醫(yī)學(xué)院)

    腦卒中是急性腦循環(huán)障礙致局灶性或彌漫性腦功能缺損。根據(jù)不同病理性質(zhì)可分缺血性及出血性兩大類,出血性腦卒中主要包括腦出血(ICH)和蛛網(wǎng)膜下腔出血。腦卒中是僅次于惡性腫瘤之后第二城鄉(xiāng)居民死亡的病因,ICH是第二大腦卒中類型,約占所有腦卒中的15%,世界范圍內(nèi)ICH發(fā)病率約為25%,亞洲為50%。出血性腦卒中因其起病急、病情重、致死率高、致殘明顯、嚴(yán)重威脅著人類健康,給患者帶來(lái)沉重的家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理負(fù)擔(dān),尤其對(duì)老年人更為兇險(xiǎn)〔1〕。目前,大部分患者會(huì)接受外科手術(shù)治療,老年患者多接受內(nèi)科治療,如控制血壓、降低顱內(nèi)壓、減輕水腫等。因老年患者依從性較差,病程長(zhǎng),藥物安全性較差,往往臨床效果不盡如人意〔2〕。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腦卒中”是指一切中于風(fēng)邪突然而來(lái)的疾病,在金元以后,對(duì)于腦卒中多認(rèn)為是因“內(nèi)風(fēng)”而引起〔3〕。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者多認(rèn)為出血性腦卒中的病機(jī)是肝腎陰虛、肝陽(yáng)失斂、陽(yáng)熱化風(fēng)攜痰火上犯腦脈,導(dǎo)致出血性腦卒中〔4〕。已故國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)教授為我國(guó)當(dāng)代極富盛名的中醫(yī)學(xué)者,在中醫(yī)腦病尤其急癥方面具有卓越貢獻(xiàn)。任教授提出用“破血逐瘀法”治療出血性腦卒中,臨床療效顯著。而抵當(dāng)湯為破血逐瘀法的代表方劑,出自《傷寒論》,原治療下焦蓄血,具有活血化瘀、瀉下通腑之功效〔5〕。本實(shí)驗(yàn)選取破血逐瘀法代表方劑抵當(dāng)湯治療急性ICH模型大鼠,為其治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)藥物 抵當(dāng)湯組成:水蛭、虻蟲(chóng)、桃仁、大黃,購(gòu)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑,水煎液在減壓條件下濃縮至1 g/ml,4℃條件下保存。全煎煮過(guò)程由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥物中醫(yī)藥研究中心負(fù)責(zé)。

    1.2造模及分組 90只清潔級(jí)Wistar大鼠(半雌半雄),6周齡,體重180~220 g,購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,自由飲食。模型構(gòu)建:根據(jù)文獻(xiàn)資料,復(fù)制大鼠ICH模型〔6,7〕,模型組、抵當(dāng)湯低、中、高劑量組大鼠腹腔注射垂體后葉注射液2 U/kg,1次/d。2 w后,用改良Nath法復(fù)制ICH模型。10%水合氯醛腹腔麻醉后,仰臥固定于鼠板,右側(cè)腹股溝區(qū)備皮并消毒。分離并暴露出股動(dòng)脈,在遠(yuǎn)心端處結(jié)扎,用肝素沖洗過(guò)的微量進(jìn)樣器抽取股動(dòng)脈血50 μl后結(jié)扎并縫合。腦立體定位儀上大鼠俯臥位固定好后,頭部備皮并消毒,沿中線切開(kāi)并暴露前囟。根據(jù)腦立體定位圖譜〔8〕進(jìn)行右側(cè)尾狀核定位后緩慢注血50 μl并留針5 min,縫合頭皮,涂抹青霉素粉以防止術(shù)后感染。假手術(shù)組按上述方法操作,但不注入自體血。以Longa評(píng)分法〔9〕進(jìn)行評(píng)價(jià):0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損;1分:左前側(cè)肢體不能充分伸展;2分:行走時(shí),出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí),出現(xiàn)向患側(cè)傾斜;4分:無(wú)法獨(dú)立行走,失去意識(shí)。2~3分的大鼠為造模成功,納入實(shí)驗(yàn)。造模成功后(除假手術(shù)組18只)將其余72只SD大鼠隨機(jī)分為:模型組、抵當(dāng)湯低、中、高劑量組,每組18只。

    1.3干預(yù)及標(biāo)本采集 按照抵當(dāng)湯低劑量組:0.13 g/100 g體重;抵當(dāng)湯中劑量組:0.26 g/100 g體重;抵當(dāng)湯高劑量組:0.52 g/100 g體重,湯藥灌胃,1次/d。假手術(shù)組及模型組按1 mg/100 g體重,生理鹽水灌胃,1次/d。抵當(dāng)湯各劑量組、假手術(shù)組及模型組分別灌胃1 d、3 d、7 d后,處死各組所有大鼠,分離海馬,取患側(cè)大腦皮層。

    1.4研究?jī)?nèi)容 ①大鼠神經(jīng)功能評(píng)分:采用Garcia評(píng)分法〔10〕進(jìn)行評(píng)價(jià);②大鼠腦組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色:取治療3 d后的各組大鼠斷頭,沿針孔/冠狀位切取厚為3 mm腦組織后在固定液中保存,在生理鹽水中充分漂洗,在10%甲醛中固定24 h,梯度酒精脫水,并制作病理組織切片,HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病變及神經(jīng)元修復(fù)。③蛋白樣品的制備及重復(fù)性檢驗(yàn):取PMSF+RIPA裂解液與腦組織碎片混勻,低溫勻漿、冰上裂解后,離心,提取上清液同時(shí)棄沉淀,收集細(xì)胞,并將上清分裝于0.5 ml離心管,-80℃保存。重復(fù)性檢驗(yàn):相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)估蛋白定量重復(fù)性是否符合生物重復(fù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一致性。④差異蛋白界定及注釋與差異表達(dá)蛋白功能富集分析:以1.2倍為差異表達(dá)變化閾值,以統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)確定在各比較組中蛋白上調(diào)和下調(diào)個(gè)數(shù);并從基因本論(簡(jiǎn)稱GO)、KEGG通路進(jìn)行了詳細(xì)的蛋白注釋,并對(duì)差異蛋白的功能進(jìn)行GO二級(jí)注釋分類,根據(jù)差異表達(dá)蛋白,進(jìn)一步進(jìn)行GO分類,以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白在某些功能類型具有顯著性富集趨勢(shì)。⑤RT-PCR 定量技術(shù)檢測(cè)腦組織B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3 mRNA的表達(dá)水平:取灌胃3 d后各組大鼠腦組織,提取總RNA,并測(cè)定RNA的純度和含量以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,用2-ΔΔCt方法分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。引物:Bcl-2正向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA,反向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA;Bax正向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA,反向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA;Caspase3正向序列:CGGAGCTTGGAACGCGA,反向序列:ACACAAGCCCATTTCAGGGTA;GADPH正向序列:ACCACAGTCCATGCCATCAC,反向序列:TCCACCACCCTGTTGCTGTA。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行主差分析、t檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn),而模型組有偏癱、追尾征等行為學(xué)改變。灌胃1 d、3 d、7 d抵當(dāng)湯高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組,且7 d>3 d>1 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分,1 d、3 d抵當(dāng)湯高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于抵當(dāng)湯低劑量組(P<0.05),3 d、7 d抵當(dāng)湯中劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組,且7 d>3 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分(均P<0.05);7 d抵當(dāng)湯低劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組灌胃不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較分,n=18)

    2.2各組腦組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)整,細(xì)胞大小一致。模型組可見(jiàn)出血灶,伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),周圍可見(jiàn)壞死的神經(jīng)細(xì)胞和彌漫性增生的膠質(zhì)細(xì)胞,且神經(jīng)細(xì)胞排列散亂、細(xì)胞間隙增大,神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮。抵當(dāng)湯低、中、高劑量組也可見(jiàn)出血灶,周圍伴神經(jīng)細(xì)胞壞死及炎癥反應(yīng),但周邊大部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整,與模型組比較,抵當(dāng)湯低、中、高劑量組出血有所減少,神經(jīng)細(xì)胞排列間隙減小,整體細(xì)胞排列較為整齊。見(jiàn)圖1。

    圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE,×400)

    2.3重復(fù)性檢驗(yàn) 采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,評(píng)估蛋白定量重復(fù)性符合生物重復(fù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一致性。見(jiàn)圖2。

    A~I(xiàn):1 d假手術(shù)組、1 d抵當(dāng)湯高劑量組、1 d模型組、3 d假手術(shù)組、3 d抵當(dāng)湯高劑量組、3 d模型組、7 d模型組、7抵當(dāng)湯高劑量組、7 d模型組圖2 重復(fù)樣本間蛋白定量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分布箱線圖

    2.4不同比較組差異蛋白功能富集分析 1 d抵當(dāng)湯高劑量組/1 d模型組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為22個(gè)(11%);在1 d模型組/1 d假手術(shù)組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為112個(gè)(10%);在3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為27個(gè)(8%);在3 d模型組/3 d假手術(shù)組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為51個(gè)(10%),見(jiàn)圖3。其中1 d模型組/1 d假手術(shù)組刺激應(yīng)答蛋白p63 MAPK上調(diào)1.286倍(P<0.05),1 d治療高劑量組/1 d模型組中p63MAPK下調(diào)0.708倍(P<0.05);3 d模型組/3 d假手術(shù)組p63MAPK上調(diào)1.357倍(P<0.05);3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組p63MAPK下調(diào)0.642倍(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    A~D:3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組、3 d模型組/3 d假手術(shù)組、1 d抵當(dāng)湯高劑量組/1 d模型組、1 d模型組/1 d假手術(shù)組圖3 各比較組GO二級(jí)注釋BP(生物過(guò)程)差異蛋白分布

    2.5各組腦組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05);各治療組與模型組比較,Bcl-2 mRNA表達(dá)量均明顯升高(均P<0.05),其中以抵當(dāng)湯高劑量組表達(dá)升高最為明顯。與假手術(shù)組比較,模型組Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.05,P<0.01);各治療組與模型組比較Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05,P<0.01),以高劑量組表達(dá)降低最為明顯。見(jiàn)表2。

    表2 各組腦組織Bcl-2、Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平比較

    3 討 論

    急性ICH是主要的非創(chuàng)傷性腦損傷,并劃分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。ICH起病急、病程短,患者常突然出現(xiàn)眩暈、嘔吐、頭痛、意識(shí)障礙等〔11〕。西醫(yī)學(xué)對(duì)急性ICH常采用外科手術(shù)治療,對(duì)待老年人則采取內(nèi)科保守治療,但臨床效果不甚理想〔2〕。因此對(duì)于治療此種疾病,探尋安全性較高的藥物日趨急迫。

    祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)急性ICH的認(rèn)識(shí)歷史悠遠(yuǎn),《內(nèi)經(jīng)》中最早將腦卒中記載 “偏枯”“偏風(fēng)”等,漢代張仲景首次提出“中風(fēng)”病名〔12〕,金代劉完素首提 “中風(fēng)先兆”,并提出“中風(fēng)者,有先兆之征,凡人覺(jué)大拇指及次指麻木不仁,或手足不用,或肌肉蠕動(dòng)者,3年內(nèi)必有大風(fēng)至”。認(rèn)為腦卒中的發(fā)病機(jī)制為氣血陰陽(yáng)失調(diào),痰濕內(nèi)盛于內(nèi),肝陽(yáng)上亢,陽(yáng)動(dòng)化熱,肝風(fēng)攜痰上犯腦脈,破血妄行發(fā)病〔13〕。研究認(rèn)為熱、痰、瘀三者既是病因亦為病理產(chǎn)物,伺機(jī)發(fā)病。故提出用“破血化瘀、瀉熱醒神、化痰開(kāi)竅”的方法治療出血性腦卒中〔14,15〕。抵當(dāng)湯為“破血化瘀”之代表方劑,首見(jiàn)于《傷寒論》,由大黃、桃仁、水蛭、虻蟲(chóng)四味藥組成,其臨床治療效果顯著,但機(jī)制仍不明確。

    p63MAPK蛋白為MAPK蛋白家族中p53一員,于1998年被發(fā)現(xiàn),大量研究表明p63介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和黏附遷移方面有調(diào)控作用〔16~18〕。p63可形成寡聚體,結(jié)合DNA,反激活p53響應(yīng)基因并介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡(響應(yīng)DNA損傷)〔19〕。同時(shí)p53能通過(guò)激活促凋亡因子,同時(shí)抑制抗凋亡因子以使線粒體通透并參與凋亡程序〔20,21〕。p63由于存在啟動(dòng)子和選擇性剪切的不同,可產(chǎn)生兩大類蛋白異構(gòu)體:一類由P1啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,生成具有反式激活、氨基酸全長(zhǎng)的TAp63,其功能類似于p53,顯示出明確的促凋亡活性,能夠調(diào)節(jié)p53下游靶基因的表達(dá),阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡。另一類由P2啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,生成氨基酸截短的△Np63,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合位點(diǎn)的方式拮抗p53或TAp63,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用〔22〕。作為轉(zhuǎn)錄因子,p63可影響MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑及PI3K-AKT通路介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖相關(guān)蛋白的合成、抗凋亡等細(xì)胞事件〔23,24〕。p63能結(jié)合靶基因的p53樣應(yīng)答元件,調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子,生長(zhǎng)因子受體,由于其下游基因具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能,因此處于這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)顯得十分重要。凋亡是對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)和免疫必不可少的程序性細(xì)胞死亡途徑。其中Bcl-2家族和Caspase家族是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因。Bax及Bcl-2同屬于Bcl-2家族,Bax基因參與促凋亡,而B(niǎo)cl-2參與抑制凋亡〔25〕。Bcl-2蛋白家族能通過(guò)促進(jìn)線粒體外膜通透性(MOMP)控制并調(diào)節(jié)線粒體的凋亡途徑。MOMP使凋亡因子從線粒體釋放到胞質(zhì)中,進(jìn)一步激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔26,27〕。Caspase3被稱為死亡蛋白執(zhí)行酶,參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Caspase3作為Caspase家族中多種凋亡途徑的共同下游,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。Caspase3的激活主要依賴Cyt-c的釋放,而B(niǎo)cl-2和Bax可通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)Cyt-c等物質(zhì)釋放,從而激活Caspase3〔28〕。活化后的Caspase3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)等,進(jìn)而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)〔29〕。Bcl-2家族和Caspase家族在細(xì)胞凋亡途徑,尤其是線粒體途徑的調(diào)控起重要作用。

    綜上,急性ICH大鼠模型應(yīng)用抵當(dāng)湯后,癥狀有所改善,且高劑量效果最好。且抵當(dāng)湯能下調(diào)p63MAPK蛋白及介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路,并通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl-2及Caspase3凋亡相關(guān)基因表達(dá),從而達(dá)到治療急性ICH的效果。

    猜你喜歡
    湯高腦組織神經(jīng)功能
    基于miR-181c-3p/STAT3通路探討增液潤(rùn)燥湯治療干燥綜合征作用機(jī)制
    健脾解毒湯對(duì)脾虛濕盛證銀屑病樣大鼠皮膚屏障功能調(diào)控機(jī)制研究
    四磨湯通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路改善重度膿毒癥大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞屏障功能障礙炎癥狀態(tài)作用研究
    陽(yáng)和湯對(duì)Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應(yīng)及腫瘤免疫微環(huán)境影響的實(shí)驗(yàn)研究
    間歇性低氧干預(yù)對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    不同程度神經(jīng)功能缺損的腦梗死患者血尿酸與預(yù)后的相關(guān)性研究
    辛伐他汀對(duì)腦出血大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制探討
    日韩欧美精品免费久久 | av国产免费在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国内精品美女久久久久久| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲国产精品999在线| 人人妻人人看人人澡| 亚洲黑人精品在线| av欧美777| 久久久久亚洲av毛片大全| 激情在线观看视频在线高清| 日韩精品青青久久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲五月天丁香| 精品久久国产蜜桃| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品久久电影中文字幕| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产| 此物有八面人人有两片| 午夜福利高清视频| 色综合婷婷激情| 国产成人a区在线观看| 婷婷亚洲欧美| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜福利成人在线免费观看| 看十八女毛片水多多多| 久久这里只有精品中国| 欧美黑人巨大hd| 极品教师在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 最好的美女福利视频网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 性欧美人与动物交配| 赤兔流量卡办理| 我的老师免费观看完整版| 亚洲自偷自拍三级| 欧美乱妇无乱码| 国产精品一区二区免费欧美| 激情在线观看视频在线高清| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久久精品国产欧美久久久| aaaaa片日本免费| 亚洲黑人精品在线| 欧美在线一区亚洲| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一进一出抽搐动态| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲精华国产精华精| 久久精品国产清高在天天线| 日本熟妇午夜| 在线观看舔阴道视频| 级片在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 九九热线精品视视频播放| 亚洲国产精品成人综合色| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美性感艳星| av在线观看视频网站免费| 特级一级黄色大片| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久久久久久久大av| 精品一区二区免费观看| or卡值多少钱| 亚洲av熟女| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久亚洲精品不卡| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品精品国产色婷婷| 禁无遮挡网站| 成人美女网站在线观看视频| 又紧又爽又黄一区二区| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 亚洲五月天丁香| 丰满的人妻完整版| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲中文字幕日韩| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久久久亚洲av毛片大全| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久亚洲真实| 免费在线观看亚洲国产| 久久午夜亚洲精品久久| 综合色av麻豆| 无遮挡黄片免费观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一区福利在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 国产欧美日韩一区二区三| 永久网站在线| 赤兔流量卡办理| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲国产欧美人成| 亚洲精品影视一区二区三区av| 久久久国产成人免费| 嫩草影院入口| 久久久久久国产a免费观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 小说图片视频综合网站| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| a级毛片a级免费在线| 九九热线精品视视频播放| 国产精品乱码一区二三区的特点| 一级av片app| 淫妇啪啪啪对白视频| 韩国av一区二区三区四区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜日韩欧美国产| 在线播放无遮挡| 欧美精品啪啪一区二区三区| avwww免费| 午夜老司机福利剧场| 精品午夜福利视频在线观看一区| 午夜精品一区二区三区免费看| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产中年淑女户外野战色| 成人性生交大片免费视频hd| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品野战在线观看| av国产免费在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 无人区码免费观看不卡| 一区二区三区免费毛片| 亚洲最大成人av| 十八禁网站免费在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 十八禁人妻一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 免费av毛片视频| 国产亚洲精品久久久com| 丁香六月欧美| 日本 av在线| 性色av乱码一区二区三区2| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久久精品欧美日韩精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 精品久久久久久久久av| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产乱人视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 美女免费视频网站| 亚洲av熟女| 女人被狂操c到高潮| 麻豆一二三区av精品| 国产熟女xx| 简卡轻食公司| 午夜福利在线观看吧| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久久国产成人免费| 校园春色视频在线观看| 日韩欧美在线乱码| 一级黄色大片毛片| 色在线成人网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 18+在线观看网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩高清综合在线| 成人永久免费在线观看视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 88av欧美| 欧美日韩乱码在线| 亚洲七黄色美女视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲av成人av| 欧美zozozo另类| 成人av在线播放网站| 国产视频内射| 亚洲av二区三区四区| 久久精品影院6| 老司机午夜福利在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 精品免费久久久久久久清纯| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 99热这里只有是精品50| 国产精品国产高清国产av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲无线观看免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产免费av片在线观看野外av| 此物有八面人人有两片| av中文乱码字幕在线| 在线免费观看的www视频| 亚洲七黄色美女视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 免费在线观看日本一区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 亚洲午夜理论影院| 欧美不卡视频在线免费观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 日日夜夜操网爽| 在线天堂最新版资源| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 动漫黄色视频在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 久久午夜福利片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| netflix在线观看网站| 12—13女人毛片做爰片一| 免费看美女性在线毛片视频| 精品久久久久久久久久久久久| 久久香蕉精品热| 欧美日韩黄片免| 91狼人影院| 黄色一级大片看看| 男女下面进入的视频免费午夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲国产精品999在线| 亚洲七黄色美女视频| 午夜福利成人在线免费观看| 赤兔流量卡办理| 日韩人妻高清精品专区| 听说在线观看完整版免费高清| 两人在一起打扑克的视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产真实伦视频高清在线观看 | 丰满乱子伦码专区| 国产日本99.免费观看| 欧美日本视频| 免费看a级黄色片| 我要看日韩黄色一级片| 熟女人妻精品中文字幕| 99久久精品一区二区三区| 97碰自拍视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久国产av精品| 白带黄色成豆腐渣| 国产精品久久久久久精品电影| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲在线自拍视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久久久久午夜电影| x7x7x7水蜜桃| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久午夜福利片| 天堂网av新在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 九九热线精品视视频播放| 99久国产av精品| 久久香蕉精品热| 欧美精品国产亚洲| 精品人妻1区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲国产欧美人成| 青草久久国产| 99久国产av精品| 成人美女网站在线观看视频| 在线播放无遮挡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品午夜福利在线看| 97热精品久久久久久| av黄色大香蕉| 无遮挡黄片免费观看| 成人性生交大片免费视频hd| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲,欧美精品.| 岛国在线免费视频观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 一区二区三区免费毛片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| ponron亚洲| 亚洲内射少妇av| 人妻久久中文字幕网| 好男人电影高清在线观看| 性色avwww在线观看| 国产伦在线观看视频一区| avwww免费| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲三级黄色毛片| 又黄又爽又免费观看的视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 日韩大尺度精品在线看网址| 免费电影在线观看免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 日韩欧美精品v在线| bbb黄色大片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 51午夜福利影视在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩中文字幕欧美一区二区| 丰满的人妻完整版| 九九热线精品视视频播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美乱妇无乱码| 人妻久久中文字幕网| 欧美区成人在线视频| a级毛片a级免费在线| 久久久精品大字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲自拍偷在线| 桃红色精品国产亚洲av| 成人一区二区视频在线观看| 日本五十路高清| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩欧美三级三区| 香蕉av资源在线| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 午夜免费激情av| 又爽又黄a免费视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 一区二区三区免费毛片| 麻豆一二三区av精品| 久久久成人免费电影| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲av二区三区四区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老司机福利观看| 日韩国内少妇激情av| www日本黄色视频网| 久久久久久国产a免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 禁无遮挡网站| 成人一区二区视频在线观看| 国产免费一级a男人的天堂| 哪里可以看免费的av片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| av专区在线播放| 神马国产精品三级电影在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av日韩精品久久久久久密| av视频在线观看入口| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美中文日本在线观看视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲成人中文字幕在线播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色日韩在线| 久久久久国内视频| 在线观看免费视频日本深夜| 99国产精品一区二区蜜桃av| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 丁香欧美五月| 给我免费播放毛片高清在线观看| av黄色大香蕉| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 五月玫瑰六月丁香| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲国产精品合色在线| 欧美在线黄色| 免费观看的影片在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 色哟哟·www| 麻豆一二三区av精品| 国产三级黄色录像| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久大精品| 国产伦一二天堂av在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 丁香六月欧美| 精品一区二区免费观看| 久久久久性生活片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲内射少妇av| 亚洲人与动物交配视频| 欧美高清成人免费视频www| 深夜a级毛片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 如何舔出高潮| 亚洲经典国产精华液单 | 最新在线观看一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 长腿黑丝高跟| 亚洲精品456在线播放app | 1000部很黄的大片| а√天堂www在线а√下载| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成年人精品一区二区| 成人性生交大片免费视频hd| 成人欧美大片| av国产免费在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 免费人成在线观看视频色| av国产免费在线观看| 99热6这里只有精品| 婷婷精品国产亚洲av在线| 桃色一区二区三区在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 波多野结衣高清无吗| 国产亚洲精品久久久com| 在线国产一区二区在线| 久久亚洲精品不卡| 久久久久九九精品影院| 成人国产综合亚洲| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲美女视频黄频| 国产麻豆成人av免费视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲久久久久久中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产三级中文精品| 日韩亚洲欧美综合| av天堂中文字幕网| 极品教师在线免费播放| 老司机福利观看| 国产高潮美女av| 老鸭窝网址在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 男女之事视频高清在线观看| 国产色婷婷99| 午夜福利欧美成人| 亚洲人与动物交配视频| .国产精品久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 伊人久久精品亚洲午夜| 中国美女看黄片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久色成人| 在线观看av片永久免费下载| 国产v大片淫在线免费观看| 热99在线观看视频| 免费在线观看成人毛片| 999久久久精品免费观看国产| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 嫩草影视91久久| 欧美zozozo另类| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产高清视频在线播放一区| 我要搜黄色片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 色吧在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲精品色激情综合| 脱女人内裤的视频| 久久精品综合一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 精品乱码久久久久久99久播| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品人妻1区二区| 日韩高清综合在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 黄色女人牲交| 国产成人aa在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 久久午夜福利片| 婷婷亚洲欧美| 色综合站精品国产| 日日夜夜操网爽| 色综合亚洲欧美另类图片| 级片在线观看| 丰满乱子伦码专区| 国产黄片美女视频| 亚洲黑人精品在线| 国语自产精品视频在线第100页| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产精品亚洲美女久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩欧美国产在线观看| 午夜a级毛片| 国产人妻一区二区三区在| 成年版毛片免费区| 成年女人永久免费观看视频| www.熟女人妻精品国产| 午夜福利在线在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一区二区三区免费毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产一区二区在线av高清观看| 又爽又黄a免费视频| 国产成人福利小说| 天天一区二区日本电影三级| 一区二区三区免费毛片| 免费无遮挡裸体视频| 69人妻影院| 一本综合久久免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品一区av在线观看| 国产成人av教育| 亚洲成人久久性| 日韩亚洲欧美综合| 国产免费一级a男人的天堂| 久久久国产成人免费| 91久久精品电影网| 中国美女看黄片| 人人妻人人看人人澡| 色哟哟·www| av在线老鸭窝| 少妇丰满av| 欧美成人免费av一区二区三区| 少妇人妻一区二区三区视频| 日本黄色片子视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 久久久久久久久大av| 99热这里只有是精品50| 国产成年人精品一区二区| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲国产精品999在线| 久久99热6这里只有精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 97超视频在线观看视频| 亚洲第一电影网av| 丰满的人妻完整版| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 婷婷丁香在线五月| 亚洲成人中文字幕在线播放| av黄色大香蕉| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一级黄色大片毛片| 国产69精品久久久久777片| 亚洲av.av天堂| 亚洲成av人片在线播放无| 俺也久久电影网| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 12—13女人毛片做爰片一| 最近最新免费中文字幕在线| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久久久久大av| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲片人在线观看| 中出人妻视频一区二区| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本 av在线| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲av成人精品一区久久| 观看美女的网站| 国产高潮美女av| 99热这里只有精品一区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 女同久久另类99精品国产91| 久久99热6这里只有精品| 美女黄网站色视频| 99国产精品一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 日韩中字成人| 国产精品野战在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产三级在线视频| 亚洲av成人精品一区久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美高清性xxxxhd video| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲国产高清在线一区二区三| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲片人在线观看| 观看免费一级毛片| 亚洲国产欧美人成| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美国产日韩亚洲一区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产成人a区在线观看| 十八禁网站免费在线| 脱女人内裤的视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 丰满乱子伦码专区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久久久国内视频| 久久精品人妻少妇| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 |