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    基于p63MAPK探究抵當(dāng)湯對(duì)急性出血性腦卒中大鼠凋亡相關(guān)基因Bax/Bcl-2/Caspase3表達(dá)的影響

    2021-06-09 07:45:50肖瑤任吉祥馮麗娜蘭天野黎明全
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2021年11期
    關(guān)鍵詞:湯高腦組織神經(jīng)功能

    肖瑤 任吉祥 馮麗娜 蘭天野 黎明全

    (長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130117;2附屬醫(yī)院;3中醫(yī)學(xué)院)

    腦卒中是急性腦循環(huán)障礙致局灶性或彌漫性腦功能缺損。根據(jù)不同病理性質(zhì)可分缺血性及出血性兩大類,出血性腦卒中主要包括腦出血(ICH)和蛛網(wǎng)膜下腔出血。腦卒中是僅次于惡性腫瘤之后第二城鄉(xiāng)居民死亡的病因,ICH是第二大腦卒中類型,約占所有腦卒中的15%,世界范圍內(nèi)ICH發(fā)病率約為25%,亞洲為50%。出血性腦卒中因其起病急、病情重、致死率高、致殘明顯、嚴(yán)重威脅著人類健康,給患者帶來(lái)沉重的家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理負(fù)擔(dān),尤其對(duì)老年人更為兇險(xiǎn)〔1〕。目前,大部分患者會(huì)接受外科手術(shù)治療,老年患者多接受內(nèi)科治療,如控制血壓、降低顱內(nèi)壓、減輕水腫等。因老年患者依從性較差,病程長(zhǎng),藥物安全性較差,往往臨床效果不盡如人意〔2〕。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腦卒中”是指一切中于風(fēng)邪突然而來(lái)的疾病,在金元以后,對(duì)于腦卒中多認(rèn)為是因“內(nèi)風(fēng)”而引起〔3〕。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者多認(rèn)為出血性腦卒中的病機(jī)是肝腎陰虛、肝陽(yáng)失斂、陽(yáng)熱化風(fēng)攜痰火上犯腦脈,導(dǎo)致出血性腦卒中〔4〕。已故國(guó)醫(yī)大師任繼學(xué)教授為我國(guó)當(dāng)代極富盛名的中醫(yī)學(xué)者,在中醫(yī)腦病尤其急癥方面具有卓越貢獻(xiàn)。任教授提出用“破血逐瘀法”治療出血性腦卒中,臨床療效顯著。而抵當(dāng)湯為破血逐瘀法的代表方劑,出自《傷寒論》,原治療下焦蓄血,具有活血化瘀、瀉下通腑之功效〔5〕。本實(shí)驗(yàn)選取破血逐瘀法代表方劑抵當(dāng)湯治療急性ICH模型大鼠,為其治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)藥物 抵當(dāng)湯組成:水蛭、虻蟲(chóng)、桃仁、大黃,購(gòu)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科。按傳統(tǒng)工藝制備水煎劑,水煎液在減壓條件下濃縮至1 g/ml,4℃條件下保存。全煎煮過(guò)程由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥物中醫(yī)藥研究中心負(fù)責(zé)。

    1.2造模及分組 90只清潔級(jí)Wistar大鼠(半雌半雄),6周齡,體重180~220 g,購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w,自由飲食。模型構(gòu)建:根據(jù)文獻(xiàn)資料,復(fù)制大鼠ICH模型〔6,7〕,模型組、抵當(dāng)湯低、中、高劑量組大鼠腹腔注射垂體后葉注射液2 U/kg,1次/d。2 w后,用改良Nath法復(fù)制ICH模型。10%水合氯醛腹腔麻醉后,仰臥固定于鼠板,右側(cè)腹股溝區(qū)備皮并消毒。分離并暴露出股動(dòng)脈,在遠(yuǎn)心端處結(jié)扎,用肝素沖洗過(guò)的微量進(jìn)樣器抽取股動(dòng)脈血50 μl后結(jié)扎并縫合。腦立體定位儀上大鼠俯臥位固定好后,頭部備皮并消毒,沿中線切開(kāi)并暴露前囟。根據(jù)腦立體定位圖譜〔8〕進(jìn)行右側(cè)尾狀核定位后緩慢注血50 μl并留針5 min,縫合頭皮,涂抹青霉素粉以防止術(shù)后感染。假手術(shù)組按上述方法操作,但不注入自體血。以Longa評(píng)分法〔9〕進(jìn)行評(píng)價(jià):0分:無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損;1分:左前側(cè)肢體不能充分伸展;2分:行走時(shí),出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈;3分:行走時(shí),出現(xiàn)向患側(cè)傾斜;4分:無(wú)法獨(dú)立行走,失去意識(shí)。2~3分的大鼠為造模成功,納入實(shí)驗(yàn)。造模成功后(除假手術(shù)組18只)將其余72只SD大鼠隨機(jī)分為:模型組、抵當(dāng)湯低、中、高劑量組,每組18只。

    1.3干預(yù)及標(biāo)本采集 按照抵當(dāng)湯低劑量組:0.13 g/100 g體重;抵當(dāng)湯中劑量組:0.26 g/100 g體重;抵當(dāng)湯高劑量組:0.52 g/100 g體重,湯藥灌胃,1次/d。假手術(shù)組及模型組按1 mg/100 g體重,生理鹽水灌胃,1次/d。抵當(dāng)湯各劑量組、假手術(shù)組及模型組分別灌胃1 d、3 d、7 d后,處死各組所有大鼠,分離海馬,取患側(cè)大腦皮層。

    1.4研究?jī)?nèi)容 ①大鼠神經(jīng)功能評(píng)分:采用Garcia評(píng)分法〔10〕進(jìn)行評(píng)價(jià);②大鼠腦組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色:取治療3 d后的各組大鼠斷頭,沿針孔/冠狀位切取厚為3 mm腦組織后在固定液中保存,在生理鹽水中充分漂洗,在10%甲醛中固定24 h,梯度酒精脫水,并制作病理組織切片,HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病變及神經(jīng)元修復(fù)。③蛋白樣品的制備及重復(fù)性檢驗(yàn):取PMSF+RIPA裂解液與腦組織碎片混勻,低溫勻漿、冰上裂解后,離心,提取上清液同時(shí)棄沉淀,收集細(xì)胞,并將上清分裝于0.5 ml離心管,-80℃保存。重復(fù)性檢驗(yàn):相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)估蛋白定量重復(fù)性是否符合生物重復(fù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一致性。④差異蛋白界定及注釋與差異表達(dá)蛋白功能富集分析:以1.2倍為差異表達(dá)變化閾值,以統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)確定在各比較組中蛋白上調(diào)和下調(diào)個(gè)數(shù);并從基因本論(簡(jiǎn)稱GO)、KEGG通路進(jìn)行了詳細(xì)的蛋白注釋,并對(duì)差異蛋白的功能進(jìn)行GO二級(jí)注釋分類,根據(jù)差異表達(dá)蛋白,進(jìn)一步進(jìn)行GO分類,以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白在某些功能類型具有顯著性富集趨勢(shì)。⑤RT-PCR 定量技術(shù)檢測(cè)腦組織B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3 mRNA的表達(dá)水平:取灌胃3 d后各組大鼠腦組織,提取總RNA,并測(cè)定RNA的純度和含量以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參,用2-ΔΔCt方法分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。引物:Bcl-2正向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA,反向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA;Bax正向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA,反向序列:GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA;Caspase3正向序列:CGGAGCTTGGAACGCGA,反向序列:ACACAAGCCCATTTCAGGGTA;GADPH正向序列:ACCACAGTCCATGCCATCAC,反向序列:TCCACCACCCTGTTGCTGTA。

    1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行主差分析、t檢驗(yàn)。

    2 結(jié) 果

    2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 假手術(shù)組無(wú)神經(jīng)功能缺損表現(xiàn),而模型組有偏癱、追尾征等行為學(xué)改變。灌胃1 d、3 d、7 d抵當(dāng)湯高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組,且7 d>3 d>1 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分,1 d、3 d抵當(dāng)湯高劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于抵當(dāng)湯低劑量組(P<0.05),3 d、7 d抵當(dāng)湯中劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組,且7 d>3 d神經(jīng)功能缺損評(píng)分(均P<0.05);7 d抵當(dāng)湯低劑量組神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯高于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 各組灌胃不同時(shí)間神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較分,n=18)

    2.2各組腦組織病理學(xué)觀察 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)整,細(xì)胞大小一致。模型組可見(jiàn)出血灶,伴炎細(xì)胞浸潤(rùn),周圍可見(jiàn)壞死的神經(jīng)細(xì)胞和彌漫性增生的膠質(zhì)細(xì)胞,且神經(jīng)細(xì)胞排列散亂、細(xì)胞間隙增大,神經(jīng)細(xì)胞胞體收縮。抵當(dāng)湯低、中、高劑量組也可見(jiàn)出血灶,周圍伴神經(jīng)細(xì)胞壞死及炎癥反應(yīng),但周邊大部分神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整,與模型組比較,抵當(dāng)湯低、中、高劑量組出血有所減少,神經(jīng)細(xì)胞排列間隙減小,整體細(xì)胞排列較為整齊。見(jiàn)圖1。

    圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE,×400)

    2.3重復(fù)性檢驗(yàn) 采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,評(píng)估蛋白定量重復(fù)性符合生物重復(fù)統(tǒng)計(jì)學(xué)一致性。見(jiàn)圖2。

    A~I(xiàn):1 d假手術(shù)組、1 d抵當(dāng)湯高劑量組、1 d模型組、3 d假手術(shù)組、3 d抵當(dāng)湯高劑量組、3 d模型組、7 d模型組、7抵當(dāng)湯高劑量組、7 d模型組圖2 重復(fù)樣本間蛋白定量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分布箱線圖

    2.4不同比較組差異蛋白功能富集分析 1 d抵當(dāng)湯高劑量組/1 d模型組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為22個(gè)(11%);在1 d模型組/1 d假手術(shù)組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為112個(gè)(10%);在3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為27個(gè)(8%);在3 d模型組/3 d假手術(shù)組中刺激應(yīng)答差異蛋白個(gè)數(shù)為51個(gè)(10%),見(jiàn)圖3。其中1 d模型組/1 d假手術(shù)組刺激應(yīng)答蛋白p63 MAPK上調(diào)1.286倍(P<0.05),1 d治療高劑量組/1 d模型組中p63MAPK下調(diào)0.708倍(P<0.05);3 d模型組/3 d假手術(shù)組p63MAPK上調(diào)1.357倍(P<0.05);3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組p63MAPK下調(diào)0.642倍(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

    A~D:3 d抵當(dāng)湯高劑量組/3 d模型組、3 d模型組/3 d假手術(shù)組、1 d抵當(dāng)湯高劑量組/1 d模型組、1 d模型組/1 d假手術(shù)組圖3 各比較組GO二級(jí)注釋BP(生物過(guò)程)差異蛋白分布

    2.5各組腦組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)量明顯降低(P<0.05);各治療組與模型組比較,Bcl-2 mRNA表達(dá)量均明顯升高(均P<0.05),其中以抵當(dāng)湯高劑量組表達(dá)升高最為明顯。與假手術(shù)組比較,模型組Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)量均明顯升高(P<0.05,P<0.01);各治療組與模型組比較Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05,P<0.01),以高劑量組表達(dá)降低最為明顯。見(jiàn)表2。

    表2 各組腦組織Bcl-2、Bax和Caspase3 mRNA表達(dá)水平比較

    3 討 論

    急性ICH是主要的非創(chuàng)傷性腦損傷,并劃分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷。ICH起病急、病程短,患者常突然出現(xiàn)眩暈、嘔吐、頭痛、意識(shí)障礙等〔11〕。西醫(yī)學(xué)對(duì)急性ICH常采用外科手術(shù)治療,對(duì)待老年人則采取內(nèi)科保守治療,但臨床效果不甚理想〔2〕。因此對(duì)于治療此種疾病,探尋安全性較高的藥物日趨急迫。

    祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)急性ICH的認(rèn)識(shí)歷史悠遠(yuǎn),《內(nèi)經(jīng)》中最早將腦卒中記載 “偏枯”“偏風(fēng)”等,漢代張仲景首次提出“中風(fēng)”病名〔12〕,金代劉完素首提 “中風(fēng)先兆”,并提出“中風(fēng)者,有先兆之征,凡人覺(jué)大拇指及次指麻木不仁,或手足不用,或肌肉蠕動(dòng)者,3年內(nèi)必有大風(fēng)至”。認(rèn)為腦卒中的發(fā)病機(jī)制為氣血陰陽(yáng)失調(diào),痰濕內(nèi)盛于內(nèi),肝陽(yáng)上亢,陽(yáng)動(dòng)化熱,肝風(fēng)攜痰上犯腦脈,破血妄行發(fā)病〔13〕。研究認(rèn)為熱、痰、瘀三者既是病因亦為病理產(chǎn)物,伺機(jī)發(fā)病。故提出用“破血化瘀、瀉熱醒神、化痰開(kāi)竅”的方法治療出血性腦卒中〔14,15〕。抵當(dāng)湯為“破血化瘀”之代表方劑,首見(jiàn)于《傷寒論》,由大黃、桃仁、水蛭、虻蟲(chóng)四味藥組成,其臨床治療效果顯著,但機(jī)制仍不明確。

    p63MAPK蛋白為MAPK蛋白家族中p53一員,于1998年被發(fā)現(xiàn),大量研究表明p63介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、凋亡、分化和黏附遷移方面有調(diào)控作用〔16~18〕。p63可形成寡聚體,結(jié)合DNA,反激活p53響應(yīng)基因并介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,細(xì)胞衰老和細(xì)胞凋亡(響應(yīng)DNA損傷)〔19〕。同時(shí)p53能通過(guò)激活促凋亡因子,同時(shí)抑制抗凋亡因子以使線粒體通透并參與凋亡程序〔20,21〕。p63由于存在啟動(dòng)子和選擇性剪切的不同,可產(chǎn)生兩大類蛋白異構(gòu)體:一類由P1啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,生成具有反式激活、氨基酸全長(zhǎng)的TAp63,其功能類似于p53,顯示出明確的促凋亡活性,能夠調(diào)節(jié)p53下游靶基因的表達(dá),阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)凋亡。另一類由P2啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,生成氨基酸截短的△Np63,可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)DNA結(jié)合位點(diǎn)的方式拮抗p53或TAp63,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用〔22〕。作為轉(zhuǎn)錄因子,p63可影響MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑及PI3K-AKT通路介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖相關(guān)蛋白的合成、抗凋亡等細(xì)胞事件〔23,24〕。p63能結(jié)合靶基因的p53樣應(yīng)答元件,調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子,生長(zhǎng)因子受體,由于其下游基因具有多種細(xì)胞生物學(xué)功能,因此處于這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)顯得十分重要。凋亡是對(duì)于組織穩(wěn)態(tài)和免疫必不可少的程序性細(xì)胞死亡途徑。其中Bcl-2家族和Caspase家族是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因。Bax及Bcl-2同屬于Bcl-2家族,Bax基因參與促凋亡,而B(niǎo)cl-2參與抑制凋亡〔25〕。Bcl-2蛋白家族能通過(guò)促進(jìn)線粒體外膜通透性(MOMP)控制并調(diào)節(jié)線粒體的凋亡途徑。MOMP使凋亡因子從線粒體釋放到胞質(zhì)中,進(jìn)一步激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔26,27〕。Caspase3被稱為死亡蛋白執(zhí)行酶,參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。Caspase3作為Caspase家族中多種凋亡途徑的共同下游,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用。Caspase3的激活主要依賴Cyt-c的釋放,而B(niǎo)cl-2和Bax可通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)Cyt-c等物質(zhì)釋放,從而激活Caspase3〔28〕。活化后的Caspase3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)等,進(jìn)而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)〔29〕。Bcl-2家族和Caspase家族在細(xì)胞凋亡途徑,尤其是線粒體途徑的調(diào)控起重要作用。

    綜上,急性ICH大鼠模型應(yīng)用抵當(dāng)湯后,癥狀有所改善,且高劑量效果最好。且抵當(dāng)湯能下調(diào)p63MAPK蛋白及介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路,并通過(guò)調(diào)控Bax、Bcl-2及Caspase3凋亡相關(guān)基因表達(dá),從而達(dá)到治療急性ICH的效果。

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