非小細(xì)胞肺癌中ERCC1與PD-1的表達(dá)及其臨床意義

滕華，李影，何嚴(yán)璐琦，張洪珍

（1.華北理工大學(xué)附屬河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2.河北北方學(xué)院附屬河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院腫瘤五科，河北 石家莊 050051）

0 引言

肺癌是目前全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤之一，成為腫瘤相關(guān)死亡的重要原因[1]。在我國，肺癌的發(fā)病率和死亡率均處于惡性腫瘤前列[2]。肺癌中大約85%是非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)，傳統(tǒng)意義上，手術(shù)提供了最好的治愈機(jī)會，但不幸的是，切除率常低至25%-30%[3]。超過60%的肺癌患者在診斷時(shí)就已經(jīng)處于局部晚期或出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，此時(shí)無手術(shù)切除的可能，化療和放療則成為肺癌患者的主要治療手段[4]，但傳統(tǒng)的放化療治療效果有限，目前臨床治療上需要面對的挑戰(zhàn)依然十分嚴(yán)峻。

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1 (Excision Repair Cross Complementing 1，ERCC1)存在于人染色體19q13.2～13.3, 全長15kb, 包含10個(gè)外顯子, 編碼中含有297個(gè)氨基酸蛋白質(zhì), 其主要功能為參與DNA鏈的切割和損傷修復(fù)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)[5]；程序性死亡受體1( Programmed Death-1，PD-1)是一種免疫抑制分子，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞等均有表達(dá)，當(dāng)其與相應(yīng)配體結(jié)合后，可產(chǎn)生免疫抑制信號，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6]；ERCC1和PD-1廣泛存在于許多惡性腫瘤之中[7,8]。目前在NSCLC關(guān)于ERCC1和PD-1的相關(guān)性研究較少，本研究主要討論在NSCLC中ERCC1與PD-1的表達(dá)情況及相關(guān)性，并分析其與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系及預(yù)后關(guān)系，進(jìn)而闡明其對NSCLC發(fā)生發(fā)展所產(chǎn)生的影響及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院2014年1月至2015年12月經(jīng)手術(shù)切除并由病理科確診的98例NSCLC石蠟標(biāo)本和30例癌旁正常肺組織(距離腫瘤組織切緣＞5㎝)石蠟標(biāo)本。所選病例為初治患者，術(shù)前未接受抗腫瘤等相關(guān)治療，且隨訪資料完整。男性51例，女性47例；年齡38-80歲，中位年齡61歲，其中≤60歲45例，＞60歲53例；腺癌59例，鱗癌39例；低-中分化52例，高分化46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例；根據(jù)美國癌癥委員會(AJCC)第八版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例。生存時(shí)間規(guī)定為手術(shù)日期至死亡或末次隨訪時(shí)間。隨訪截止日期為2019年12月31日。

1.2 試劑

兔抗PD-1單克隆抗體、鼠抗人ERCC1單克隆抗體均購自美國Abcam公司；SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其余所需試劑和實(shí)驗(yàn)儀器均由我院病理科提供。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)法檢測ERCC1及PD-1。目標(biāo)蠟塊切片5μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，進(jìn)行高溫抗原修復(fù)；以3%的過氧化氫溫育20min滅活內(nèi)源性過氧化物酶；滴加正常血清封閉液，室溫溫育30 min，除去多余液體；滴加一抗(鼠抗人ERCC1單抗、兔抗PD-1單抗)，放置一夜；次日取出，PBS液洗滌3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，PBS液洗滌3次，每次5 min；滴加試劑SABC，PBS液洗滌3次，每次5 min；DAB顯色5min；蘇木素復(fù)染2min。乙醇脫水，二甲苯透明，吹風(fēng)機(jī)吹干后中性樹脂封片。陰性對照由PBS代替一抗(余操作步驟相同)。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

1.4.1 PD-1結(jié)果判定

評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[9]標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞膜或者細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或者棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。按腫瘤陽性細(xì)胞百分比與細(xì)胞顯色強(qiáng)度分別進(jìn)行記分，采用半定量法進(jìn)行評價(jià)：陽性細(xì)胞數(shù)分為＜1%計(jì)0分，1%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；顯色強(qiáng)度分為無顯色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，棕黃色計(jì)3分。兩項(xiàng)乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4.2 ERCC1結(jié)果判定

評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn)，陽性細(xì)胞數(shù)分為無陽性細(xì)胞計(jì)為0，1%～9%計(jì)為0.1，10%～50%計(jì)為0.5，＞50%計(jì)為1.0。顯色程度分為無顯色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)乘積≥2認(rèn)定為陽性，反之為陰性。

全部切片由我院2名病理科專業(yè)人員隨機(jī)獨(dú)立閱片后，取平均分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級相關(guān)。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，Log-Rank法進(jìn)行預(yù)后的單因素分析，多因素生存分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERCC1和PD-1在NSCLC組織和正常肺組織中的表達(dá)

ERCC1在NSCLC組織中的表達(dá)低于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而PD-1在NSCLC組織中的表達(dá)高于正常肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表1。

表1 ERCC1、PD-1在肺癌標(biāo)本和正常組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)率[n(%)]

2.2 ERCC1及PD-1的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系ERCC1陽性表達(dá)

在TNM分期為Ⅰ期～Ⅱ期的患者中顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PD-1陽性表達(dá)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期為Ⅲ期的患者中顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；二者表達(dá)均與性別、年齡、病理類型、分化程度無關(guān)(P＞0.05)，詳見表2。

表2 ERCC1及PD-1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 ERCC1和PD-1的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

ERCC1陽性表達(dá)組的5年生存率為30.60%，中位生存期為45.0個(gè)月；陰性組的5年生存率為14.30%，中位生存期為29.0個(gè)月；兩組間生存率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.013，P=0.014）（圖1）。PD-1陽性表達(dá)組的5年生存率為11.10%，中位生存期為28.0個(gè)月；陰性組的5年生存率為29.00%，中位生存期為40.0個(gè)月；兩組間生存率的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（χ2=7.147，P=0.008）（圖2）。

圖1 ERCC1陽性組與陰性組的生存曲線

圖2 PD-1陽性組與陰性組的生存曲線

經(jīng)Cox多因素分析，結(jié)果顯示：僅TNM分期（P=0.011，95%CI:1.203-4.092，RR=2.219）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.043，95%CI:1.020-3.157，RR=1.794）是影響預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ERCC1和PD-1的表達(dá)并非預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，詳見表3。

表3 影響NSCLC預(yù)后Cox多因素分析

2.4 NSCLC組織中ERCC1及PD-1表達(dá)的相關(guān)性

49例ERCC1陽性表達(dá)中，有19例PD-1陽性表達(dá)；49例ERCC1陰性表達(dá)中，有32例PD-1陰性表達(dá)，詳見表4。Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ERCC1和PD-1在NSCLC中的表達(dá)無明顯相關(guān)性（rs=0.042，P＞0.05）。（表4）

表4 ERCC1及PD-1在NSCLC組織中表達(dá)的相關(guān)性(n)

3 討論

肺癌作為常見的惡性腫瘤之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康[1,2]。2015年Chen等[2]基于中國惡性腫瘤現(xiàn)狀大數(shù)據(jù)指出，肺癌是引起男性和女性癌癥死亡的五大原因之一，其中肺癌的發(fā)病率占男性惡性腫瘤之首，而在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。在科學(xué)技術(shù)日新月異的年代，肺癌的治療已經(jīng)進(jìn)入到個(gè)體化治療階段，本研究通過聯(lián)合檢測ERCC1和PD-1，企圖從基因環(huán)境和免疫微環(huán)境兩方面來探討腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，為NSCLC的治療提供參考意義。

ERCC1是核苷酸切除修復(fù)過程中的限速酶，也是DNA修復(fù)基因家族中的重要成員之一，ERCC1 mRNA的低表達(dá)提示核苷酸切除修復(fù)能力降低，導(dǎo)致肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加[10]，高水平表達(dá)與順鉑制劑耐藥有關(guān)[11]。目前對于ERCC1與臨床病理特征的關(guān)系報(bào)道尚無定論。Ota S等[12]研究顯示，ERCC1的表達(dá)與性別、年齡、吸煙情況、病理分期無關(guān)，而與病理類型有關(guān)。Deng等[13]報(bào)道ERCC1在癌組織和癌旁組織的表達(dá)，與性別、年齡、吸煙情況、病理類型無關(guān)，與腫瘤TNM分期有關(guān)，與本研究結(jié)果相近。近年來有關(guān)ERCC1與肺癌預(yù)后關(guān)系的說法不一，多數(shù)研究認(rèn)為NSCLC早期患者，ERCC1是預(yù)后良好的指標(biāo)，其高表達(dá)有利于延長生存時(shí)間，而晚期患者，ERCC1影響化療導(dǎo)致耐藥，其高表達(dá)往往降低生存期[5,8,12,13]。本研究結(jié)果提示ERCC1陽性患者的預(yù)后好于陰性患者，且與生存顯著相關(guān)，考慮與病例大多為早期患者有關(guān)。多因素分析顯示ERCC1不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，但進(jìn)一步亞組分析顯示I～I(xiàn)I期ERCC1陽性表達(dá)者的生存趨勢好于Ⅲ期ERCC1陽性表達(dá)者(P＜0.05)。

PD-1多存在于活化的T細(xì)胞表面, 與配體PD-L1結(jié)合后會抑制相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫自身穩(wěn)定功能, 阻止免疫激活造成的機(jī)體損傷，這也成為腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的主要機(jī)制之一[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在肝癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[15-17]。有報(bào)道[18]表明PD-1在NSCLC組織中的高表達(dá)狀態(tài)與患者的臨床病理特征及無進(jìn)展生存期無關(guān)。Yin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1的表達(dá)與吸煙情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且其與預(yù)后相關(guān)，陽性表達(dá)者生存期短，預(yù)后差。本研究結(jié)果顯示PD-1在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，PD-1陰性患者的5年生存率及中位生存期好于陽性患者，但PD-1不是影響預(yù)后的獨(dú)立因素，這一結(jié)果與Yin等[19]研究結(jié)果相符。

肺癌的發(fā)生十分復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為它是一個(gè)多重因素參與并經(jīng)歷多個(gè)發(fā)展階段的疾病，是個(gè)體遺傳因素和環(huán)境危險(xiǎn)因素相互作用的結(jié)果。ERCC1作為基因修復(fù)過程中的重要因素, 成為研究熱點(diǎn)，而PD-1是免疫治療與腫瘤微環(huán)境中重點(diǎn)研究對象。本研究探討了ERCC1和PD-1的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)二者并無關(guān)聯(lián)，目前對于ERCC1和PD-1共表達(dá)的研究尚少，還需更多的研究驗(yàn)證二者關(guān)系。

綜上所述，ERCC1和PD-1在NSCLC組織中均有不同程度的表達(dá)，聯(lián)合檢測癌組織中ERCC1和PD-1對NSCLC早期診斷和精準(zhǔn)化、個(gè)體化治療具有重要意義。