膿毒癥與非膿毒癥的SIRS關(guān)鍵差異蛋白的篩選與鑒定

覃慧嬋，劉鳳鳴，謝馥懋

(廣西南寧市第一人民醫(yī)院（廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院）重癥醫(yī)學(xué)科, 廣西 南寧 530022)

0 引言

膿毒癥（Sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其病情進(jìn)展快，且通常在短時間內(nèi)可繼發(fā)多器官功能障礙，甚至危及患者的生命，近年來，膿毒癥的發(fā)病率呈逐年升高趨勢，且膿毒癥病死率高、治療費用高，目前已對臨床工作造成巨大的挑戰(zhàn)，然而早期識別膿毒癥，盡早開展膿毒癥救治能顯著降低膿毒癥患者的死亡率，減少治療成本，并能改善預(yù)后等[1,2]，然而，在臨床工作中，膿毒癥與非膿毒癥的SIRS的鑒別仍然存在困難，除了根據(jù)患者的癥狀、體征外，目前臨床上用于兩者鑒別的血清生物學(xué)標(biāo)志物有C反應(yīng)蛋白（CRP)、白介素類（IL-6、IL-10）及降鈣素原（PCT）等，但臨床上發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-10、CRP、PCT等血清生物學(xué)標(biāo)志物用于兩者鑒別的敏感性及特異性不高，臨床應(yīng)用價值有限[3,4]。因此，尋找敏感性高、特異性強的能夠用于膿毒癥與非膿毒癥的SIRS鑒別的新型血清生物學(xué)標(biāo)志物是臨床醫(yī)學(xué)的研究重點之一。

定量蛋白組學(xué)是把一個復(fù)雜的混合體系中的所有蛋白質(zhì)或一個組織基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定的一門學(xué)科。目前，定量蛋白組學(xué)是繼人類全基因組計劃完成之后研究的熱點之一，是目前蛋白組學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。對復(fù)雜體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量主要有雙向凝膠電泳技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)及應(yīng)用同位素標(biāo)記聯(lián)合液相色譜及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。目前對膿毒癥的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要方法為雙向凝膠電泳技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，Thongboonkerd V 等[5]對腹膜炎引起的膿毒癥進(jìn)行研究，利用雙向凝膠電泳技術(shù)分離出膿毒癥豬模型的血漿，以期發(fā)現(xiàn)在膿毒癥早期階段發(fā)生改變的血漿蛋白質(zhì)，該研究共發(fā)現(xiàn)1500個蛋白質(zhì)樣點，并選擇在膿毒癥中表現(xiàn)的36個差異蛋白進(jìn)行鑒定，利用四極桿飛行時間質(zhì)譜( quadrupole-time-of-flight MS) 和串聯(lián)質(zhì)譜( tandem MS)技術(shù)，最終鑒定到膿毒癥血漿中的差異蛋白有30個，其中在膿毒癥患者中上調(diào)的差異蛋白為22個，在膿毒癥患者中顯著下調(diào)的差異蛋白為5個，并通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC- MS/MS技術(shù)是目前為止最先進(jìn)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可對生理、病理狀態(tài)下多個時間點的差異蛋白進(jìn)行定性及定量分析[6]，具有高通量、高定量精度、高分辨率、高重復(fù)性等特點[7]。應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC- MS/MS技術(shù)對膿毒癥進(jìn)行研究的文獻(xiàn)極少，國內(nèi)外共有3篇報道，SU等[8]應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC- MS/MS技術(shù)對膿毒癥及SIRS患者的尿液進(jìn)行定量蛋白組學(xué)研究，共發(fā)現(xiàn)表達(dá)有顯著差異的蛋白34種，并通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這34種差異蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等。

本課題組前期實驗通過定量蛋白組學(xué)技術(shù)iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS篩選出膿毒癥與非膿毒癥的SIRS患者血清中的差異蛋白，共發(fā)現(xiàn)上調(diào)的蛋白有311種，下調(diào)的蛋白有110種，包括PDIA1、PADI4、GSTA1、MNDA等，并通過生物信息學(xué)方法對鑒定到的差異蛋白進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。上述實驗具有高通量、高定量精度等特點，但鑒定到的蛋白存在一定的假陽性，需要進(jìn)一步驗證，本項目采用ELISA對兩者的關(guān)鍵差異蛋白PDIA1、GSTA1進(jìn)行表達(dá)驗證，以期作為膿毒癥與非膿毒癥的SIRS鑒別的新型血清生物標(biāo)志物，進(jìn)而提高膿毒癥的診療水平。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本的收集與保存

收集南寧市第一人民醫(yī)院2019年01月至2019年06月期間的膿毒癥患者、非膿毒癥的SIRS患者的血清，所有血清標(biāo)本均經(jīng)過患者或家屬的知情同意，其入選符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。并根據(jù)性別、年齡進(jìn)行匹配，兩組研究對象在性別、年齡上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。所有血清樣品均為清晨空腹時使用真空采血管采集，在4℃，3000g的條件下離心10min，收集上清液，冰上分裝后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 兩組患者基本信息

非膿毒癥的SIRS組：30例，年齡20～80歲，非感染因素作用于機體所引起的全身性炎癥反應(yīng)，且具備以下2項或2項以上體征：體溫＞38℃或＜36℃,心率＞90次/分，呼吸頻率＞20次/分，或PaCO2＜32mmHg，外周血白細(xì)胞計數(shù)＞12×109/L，或未成熟粒細(xì)胞＞0.1。

膿毒癥組：30例，年齡20～80歲，由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，證實有細(xì)菌存在或有高度可疑感染灶，其診斷標(biāo)準(zhǔn)同SIRS。

1.2 差異蛋白表達(dá)的驗證

應(yīng)用ELISA對PDIA1、GSTA1進(jìn)行表達(dá)驗證，PDIA1、GSTA1兩種ELISA試劑盒均購自凡科維。

ELISA實驗步驟：

（1）將凍存的標(biāo)本在冰上解凍后分別取出100μl 備用。

（2）分別取標(biāo)準(zhǔn)品100ul依次加入1排7孔中，1孔只加樣品稀釋液作為零孔。

（3）酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘。

（4）甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體，再對著吸水紙拍幾下，不洗。

（5）每孔依次加入抗體工作液100μl，37℃反應(yīng)30分鐘。

（6）用洗滌液洗滌3次，每次浸泡1分鐘左右，甩去多余液體。

（7）每孔依次加入TMB顯色液100μl，37℃避光反應(yīng)20-25分鐘。

（8）每孔依次加入TMB終止液100μl，此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色。

（9）用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值。

（10）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)吸光值計算出相應(yīng)孔的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件。呈正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)（n）表示，組間比較采用卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 本課題組前期實驗

通過定量蛋白組學(xué)技術(shù)iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS篩選出膿毒癥與非膿毒癥的SIRS患者血清中的差異蛋白，共發(fā)現(xiàn)上調(diào)的蛋白有311種，下調(diào)的蛋白有110種，包括PDIA1、PADI4、GSTA1、MNDA等，并通過生物信息學(xué)方法對鑒定到的差異蛋白進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。如圖1所示。

圖1 生物學(xué)過程

2.2 用ELISA分別檢測非膿毒癥的SIRS組、膿毒癥組中的PDIA1、GSTA1表達(dá)情況

結(jié)果如表2所示，非膿毒癥的SIRS組、膿毒癥組中的PDIA1、GSTA1比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組中PDIA1、GSTA1表達(dá)情況

3 討論

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和醫(yī)療服務(wù)水平的不斷提高，危害人類健康的疾病逐步得到有效控制，但膿毒癥仍嚴(yán)重影響患者的生命和生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。膿毒癥目前已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，是臨床上危重癥患者的常見并發(fā)癥，具有發(fā)病率高、死亡率高、病情進(jìn)展快等特點，是臨床救治工作中的重點及難點。目前為止，國內(nèi)外有大量學(xué)者對膿毒癥的診治進(jìn)行了相關(guān)的研究，但尚缺乏敏感性及特異性均高且能夠用于鑒別膿毒癥與非膿毒癥的SIRS的生物標(biāo)志物。

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，定量蛋白質(zhì)組學(xué)已成為目前研究蛋白質(zhì)的熱點領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供無可替代的平臺，是后基因組時代的重要里程碑。目前常用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)包括以下三種：同位素親和標(biāo)記(ICAT)、熒光差異凝膠電泳（DIGE）、同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）[9]。iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)是近年來開發(fā)的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù), 具有高通量、高精度、高分辨率、高重復(fù)性等無可替代的優(yōu)勢，已逐步替代了DIGE、ICAT等傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，已成為目前最理想的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)[10]。

PDIA1（protein disulfide isomerase A1）即蛋白質(zhì)二硫化異構(gòu)酶A1，目前為止在國內(nèi)對該蛋白的研究較少，僅有1篇文獻(xiàn)報道，曾亮[11]等研究發(fā)現(xiàn)PDIA1在左側(cè)結(jié)腸癌的表達(dá)顯著高于右側(cè)結(jié)腸癌，在膿毒癥方面尚未見文獻(xiàn)報道。國外Kullmann M[12]等研究發(fā)現(xiàn)PDIA1可用于評估順鉑在治療卵巢癌中的療效，判斷預(yù)后，但未見PDIA1在膿毒癥方面的研究報道。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，PDIA1在膿毒癥組的表達(dá)顯著高于非膿毒癥的SIRS組，且PDIA1經(jīng)過ELISA驗證，與蛋白組學(xué)的研究結(jié)果一致，提示PDIA1有望用于鑒別膿毒癥與非膿毒癥的SIRS，值得進(jìn)一步研究。

GSTA1(glutathinoe S-transferase A1)即谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1，能避免體內(nèi)的一些DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等遭受體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧產(chǎn)物帶來的的毒性損傷，是人體內(nèi)發(fā)揮分解代謝活性氧產(chǎn)物等有毒物質(zhì)的II相代謝酶家族的重要成員，進(jìn)而避免機體遭受氧化應(yīng)激的損傷[13]。目前國內(nèi)外對GSTA1報道不多，主要用于肺癌、結(jié)腸癌等研究，GSTA1在膿毒癥方面國內(nèi)外均未見報道，本研究發(fā)現(xiàn)GSTA1在膿毒癥組的表達(dá)顯著低于非膿毒癥的SIRS組，且GSTA1經(jīng)過ELISA驗證，與蛋白組學(xué)的研究結(jié)果一致，提示GSTA1有望用于鑒別膿毒癥與非膿毒癥的SIRS，值得進(jìn)一步研究。

總之，應(yīng)用iTRAQ標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)能很好的進(jìn)行膿毒癥的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，有利于尋找膿毒癥的血清生物標(biāo)志物，有良好的應(yīng)用前景。本研究篩選出的差異蛋白PDIA1、GSTA1有望成為潛在的膿毒癥血清生物標(biāo)志物，但因本研究的例數(shù)較少，其臨床意義有待進(jìn)一步研究。