禽活疫苗中網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒污染的檢測方法比較

李雪蓮

摘? 要：本研究隨機(jī)抽取4種市售活疫苗，利用RT-PCR法、IFA檢測法和SPF雞檢查法，檢測活疫苗中的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的污染，比較三種檢測方法的優(yōu)劣以找到更好檢測的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，RT-PCR法雖然方便、快捷，但RT-PCR法檢測會產(chǎn)生假陽性，影響結(jié)果的判定;SPF雞檢查法操作簡單結(jié)果可靠，但該方法試驗(yàn)周期較長，成本高;IFA檢測法與傳統(tǒng)雞檢查法相比具有快速、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)點(diǎn)，利于推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：IFA檢測法;RT-PCR;SPF雞檢查法;禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒;家禽活疫苗

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（Reticuloendotheliosis，RE）是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）引起的禽類以急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤、生長抑制綜合征、淋巴組織及其他組織慢性腫瘤形成為特征的一群病理綜合征[1-2]。由于REV可以通過種蛋垂直傳播，如果使用污染有REV的雞胚生產(chǎn)的疫苗會造成疫苗中污染REV，這是REV獨(dú)特的傳播途徑之一[3]。REV是活疫苗污染中常見的一種外源病毒，當(dāng)被污染的疫苗免疫雞群后可引起雛雞免疫抑制和矮小綜合征，從而給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外均有因REV污染疫苗引起嚴(yán)重?fù)p失的案例和報(bào)道[4-6]。對禽源活疫苗進(jìn)行REV污染檢測，確保疫苗使用的有效性和安全性，是防止REV傳播的重要手段。

目前對疫苗中REV污染的檢測，我國應(yīng)用方法主要包括細(xì)胞培養(yǎng)法和接種SPF雞檢查法，其中接種SPF雞檢查法被認(rèn)為是經(jīng)典的“金標(biāo)準(zhǔn)”，檢測結(jié)果相對可靠容易判定，但缺點(diǎn)是檢測周期長。通常情況下，家禽活疫苗中REV等外源病毒的污染需要用非常靈敏、特異性強(qiáng)、檢測周期短的方法來進(jìn)行檢測。RT-PCR法、IFA檢測法和SPF雞檢查法，目的就是為了找到更為合理的檢測家禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的檢測方法。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑? 雞新城疫病毒（La Sota株）陽性血清、雞傳染性法氏囊病陽性血清、REV特異性抗體，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG，購自Sigma公司;網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV），山東農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng);REV抗體ELISA檢測試劑盒，購自美國IDEXX公司。

1.1.2? 疫苗? 雞新城疫活疫苗（La Sota株）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）、雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株）和雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota株+QXL87株）。

1.1.3? 試驗(yàn)動(dòng)物? SPF雞胚和SPF雞均購自勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? RT-PCR檢測法

1.2.1.1? 樣品處理? 將疫苗分別用2 mL滅菌0.01 mol/L PBS還原。

1.2.1.2? 引物設(shè)計(jì)? 根據(jù)GenBank中登錄的REV群特異性抗原env的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，由華大基因合成，擴(kuò)增目的基因片段長度為476 bp。引物序列如下：

上游引物：5'- GCGTTAAGGACCTGGTGAGTAGC -3';

下游引物：5'- GGGATTTAGACAACAGTGGGAGT -3'。

1.2.1.3? 核酸提取與凝膠電泳? 按照艾科瑞生物公司一步法（RT-PCR）試劑盒說明書操作，進(jìn)行核酸提取與基因擴(kuò)增，采用凝膠電泳鑒定。

反應(yīng)體系為20 μL：2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 5 μL。

反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條件：取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠在120 V電泳。

1.2.2? IFA檢測法

1.2.2.1? 制備雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）? 參照《中華人民共和國獸藥典》附錄方法制備[7]。

1.2.2.2? 疫苗的處理及接種? 將雞新城疫活疫苗（La Sota株）和雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota株+QXL87株）分別用無血清的M-199培養(yǎng)液溶解，使最終為200羽份/0.8 mL，以4 ℃、10000 g離心10 min。取離心后的上清液與等量的雞新城疫病毒特異性抗血清混勻，37 ℃中和60 min，取中和液1.6 mL接種CEF細(xì)胞。

將雞傳染性法氏囊活疫苗（B87株）用無血清的M-199培養(yǎng)液溶解，使最終為500羽份/2 mL，以4 ℃、10000 g離心10 min。取離心后的上清液與等量的雞傳染性法氏囊病病毒特異性抗血清混勻，37 ℃中和60 min，取中和液4.0 mL接種CEF細(xì)胞。

將雞傳染性支氣管炎活疫苗（H120株）用無血清的M-199培養(yǎng)液溶解，使最終為500羽份/2 mL，以4 ℃、10000 g離心10 min。取離心后的上清液2.0 mL接種CEF細(xì)胞[7]。

1.2.2.3? 病毒對照? 將雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）稀釋至10 TCID50/mL，取1.0 mL接種至CEF單層作為陽性對照。

1.2.2.4? 細(xì)胞培養(yǎng)的傳代? 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，按常規(guī)方法消化、收獲細(xì)胞，將其中1/10細(xì)胞用2.0 mL含3%新生牛血清的M-199培養(yǎng)液懸浮，接種4孔48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種0.5 mL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 d，進(jìn)行熒光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2.5? 熒光染色? 采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）進(jìn)行，具體方法參照2015年版《中華人民共和國獸藥典》三部附錄3304禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒檢驗(yàn)法進(jìn)行[7]。

1.2.3? SPF雞檢查法

1.2.3.1? 樣品處理? 每瓶樣品加入5 mL無菌PBS溶解，同一樣品取3瓶疫苗混合均勻作為待檢樣品，最終濃度為20羽份/0.1 mL。

1.2.3.2? 免疫接種? 適于接種本疫苗日齡的SPF雞20只/組，每只雞同時(shí)點(diǎn)眼、滴鼻接種10羽份疫苗，肌肉注射100羽份疫苗;21 d后，按上述方法和劑量重復(fù)接種1次。第1次接種后42 d采血。采用商品化的IDEXX網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥抗體檢測試劑盒，檢測REV特異性抗體[6]。S/P值=（血清樣品的OD650nm-陰性對照的OD650nm）/（陽性對照的OD650nm-陰性對照的OD650nm）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? RT-PCR檢測法? 檢測結(jié)果見表1。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)顯示REV病毒陽性對照出現(xiàn)470 bp亮度很高的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致，陰性對照和四種被檢活疫苗均未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測結(jié)果說明該疫苗樣品沒有污染禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

2.2? IFA檢測法? 采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）分別檢測不同活疫苗樣品中細(xì)胞培養(yǎng)分離的REV抗原，結(jié)果見表1和圖2。

通過表1和圖2檢測結(jié)果可知，陽性對照的細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，出現(xiàn)特異性綠色熒光，熒光聚集在胞漿中，且熒光較亮。四種活疫苗樣品和陰性對照中均未出現(xiàn)特異性綠色熒光，說明四種疫苗樣品沒有污染禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

2.3? SPF雞檢查法? 使用美國IDEXX公司REV抗體ELISA檢測試劑盒，檢測不同疫苗樣品免疫的20只SPF雞血清抗體，結(jié)果見表2。

檢測結(jié)果顯示四種疫苗免疫組及對照組血清REV抗體S/P值范圍在-0.020～0.200之間，均小于0.5，檢測結(jié)果全部判定為陰性，即四種疫苗樣品沒有污染禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒。

3? 討論與結(jié)論

PCR法不需要對樣品進(jìn)行任何處理，直接從樣本中提取DNA，當(dāng)日即可對樣品做出定性的檢測，結(jié)果可疑當(dāng)天便可重檢，所以PCR法具有快捷、方便、結(jié)果判定更為直觀等優(yōu)點(diǎn);RT-PCR是反轉(zhuǎn)錄與PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)體系進(jìn)行，大大提高了反應(yīng)效率。PCR和RT-PCR均可用于疫苗中REV污染情況的監(jiān)測。莊金秋等[8]用REV的LTR基因序列設(shè)計(jì)引物建立了PCR方法用于疫苗污染REV的檢測，經(jīng)與間接免疫熒光法進(jìn)行同步比較試驗(yàn)，結(jié)果吻合性較高。Award等[9]用PCR方法在雞痘病毒疫苗樣品中檢測到REV核酸陽性。葛兆宏等[10]和畢研麗等[11]分別建立RT-PCR法用于REV的檢測。為了提高檢測的敏感性和特異性，Luan等[12]利用建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測到疫苗中有REV污染。黃小潔[13]運(yùn)用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對17批禽用活疫苗進(jìn)行檢測，并與間接免疫熒光法（IFA）進(jìn)行同步比較試驗(yàn)，結(jié)果兩者符合率為100%。但要注意不少情況下REV的基因組可以部分或全部整合到宿主細(xì)胞或其它病毒的基因組中，這時(shí)再用PCR方法檢測就會產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

根據(jù)《中華人民共和國獸藥典》中外源病毒檢驗(yàn)要求，我國禽源制品的外源病毒檢驗(yàn)主要是雞胚檢查法、細(xì)胞檢查法和雞檢查法。通常情況下，可采用雞胚檢查法和細(xì)胞檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，如檢驗(yàn)無結(jié)果或結(jié)果可疑時(shí)，用雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)[7]。這一方法操作簡單、結(jié)果可靠，也更具說服力，不會受到其它因素的干擾，但該方法缺點(diǎn)在于試驗(yàn)周期較長、成本高且需要具有SPF雞的飼養(yǎng)條件方可開展檢測。

雖然IFA檢測法需要對疫苗樣品進(jìn)行中和處理（不同種類疫苗處理方法不同），接種CEF傳代，再進(jìn)行IFA檢測，檢測需要熒光顯微鏡，需要具有中和效價(jià)較高的特異性REV陽性血清和FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG，但是IFA檢測方法與傳統(tǒng)雞檢查法相比具有檢測周期短、操作簡便、不需要試驗(yàn)動(dòng)物、成本低等優(yōu)點(diǎn);而且IFA檢測方法具有較高的敏感性，該方法的建立進(jìn)一步完善了禽用活疫苗外源病毒的檢驗(yàn)體系，為有效防控禽用活疫苗污染外源病毒提供了更可行有效的檢驗(yàn)手段。孫淼等[14]用間接免疫熒光法（IFA）對雞痘病毒活疫苗進(jìn)行了檢驗(yàn)，疫苗REV檢測為陽性，隨后按雞檢查法進(jìn)行外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果兩種方法對REV污染的檢測結(jié)果的符合率為100%。李啟紅等[15]用IFA檢測法對43批馬立克氏病活疫苗進(jìn)行檢驗(yàn)，其中4批疫苗REV檢測為陽性，用雞檢查法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明兩種檢測方法完全符合。

總之，IFA檢測方法是檢測家禽活疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒污染的行之有效的方法，與傳統(tǒng)雞檢查法相比具有快速、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)點(diǎn)，更利于推廣應(yīng)用。

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