張敏鴻,曾 勇,盧洪飛
血管瘤是嬰幼兒時(shí)期較為常見(jiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖所致的一種良性腫瘤,發(fā)病率為4%~5%,其發(fā)病機(jī)制尚未明晰[1]。大多數(shù)血管瘤病變可自然消退,但部分患者瘤體生長(zhǎng)在關(guān)鍵部位,導(dǎo)致潰瘍、毀容或器官功能損害,甚至危及生命[2]。目前,雖然普萘洛爾已成為血管瘤治療的臨床一線藥物,但仍存在部分患者對(duì)普萘洛爾耐藥以及復(fù)發(fā)等情況,增加了治療難度。因此,研究血管瘤進(jìn)展過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)通路,可為血管瘤分子靶向藥物研發(fā)提供新的思路。血管的生成及發(fā)生受細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的精密調(diào)節(jié),血管瘤的發(fā)生發(fā)展與多條信號(hào)通路異常、失活密切相關(guān),包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Ang-Tie信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,Ras)信號(hào)通路等[3-4]。Sonic Hedgehog是一條調(diào)控分泌信號(hào)蛋白、進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路[5],其在控制胚胎發(fā)育和成體組織穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要,對(duì)包括細(xì)胞增殖、凋亡在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用[6]。Sonic Hedgehog信號(hào)通路在血管生成及發(fā)生中發(fā)揮重要作用,在胰腺癌、肝癌、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心臟病等病理?xiàng)l件下可見(jiàn)其異常表達(dá)[7-10]。本研究旨在分析Sonic Hedgehog信號(hào)通路對(duì)小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(mouse hemangioma endothelial cells,EOMA細(xì)胞)增殖的影響,以探討Sonic Hedgehog信號(hào)通路對(duì)血管瘤發(fā)生發(fā)展的作用及其可能的分子機(jī)制,為血管瘤的治療和診斷提供新的思路。
1.1實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,F(xiàn)orma 311)、潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD,上海博迅)、熒光定量PCR儀(Bio-Rad,CFX3.1)、流式細(xì)胞儀(BD,FACSCalibur)、連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher,Varioskan Flash)、超純水儀(Millipore,RiOs5+Milli-Q Biocel)、萬(wàn)向脫色搖床(北京六一,WD-9405B)等。
1.2實(shí)驗(yàn)材料與試劑 EOMA細(xì)胞系(由贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心保藏并提供);高糖Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)粉劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Sonic Hedgehog信號(hào)通路抑制劑GANT61、Sonic Hedgehog信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG等購(gòu)于上海碧云天公司。所有化學(xué)試劑均達(dá)分析純。
1.3細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)EOMA細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)以0.25%胰酶消化,1 000 r/min離心5 min,傳代,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù),接種2×103個(gè)EOMA細(xì)胞于96孔板,最終工作體積為200 μl。設(shè)調(diào)零組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組,各孔均重復(fù)3次。EOMA細(xì)胞培養(yǎng)12 h后,加入不同濃度的GANT61及二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),GANT61工作濃度分別為10、20、40、80、160 μmol/L,DMSO含量不高于0.1%。培養(yǎng)24、48、72 h后,加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h,吸棄上清,每孔加入150 μl DMSO。酶標(biāo)儀測(cè)量各孔490 nm波長(zhǎng)處的光密度OD吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)×100%。應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件計(jì)算GANT61作用EOMA細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50),選擇合適濃度范圍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.5EdU染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù),接種2×105個(gè)EOMA細(xì)胞于6孔板,細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。加入20、40、80 μmol/L濃度的GANT61及DMSO,藥物處理24 h。培養(yǎng)基更換為1 ml 10 μM EdU培養(yǎng)基,孵育2 h,0.25%胰酶消化,1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞,加入1 ml 4%多聚甲醛固定15 min后,1 000 r/min離心5 min棄上清。加入2 ml 2 mg/ml甘氨酸中和5 min,1 000 r/min離心5 min棄上清。2 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗1次,加入0.5% TritonX-100滲透劑室溫孵育10 min,2 ml PBS清洗1次。加入200 μl Apollo染色反應(yīng)液,避光孵育10 min,1 000 r/min離心5 min棄上清,加入3 ml 0.5% TritonX-100滲透劑清洗1次,1 000 r/min離心5 min棄上清,500 μl PBS重懸細(xì)胞,流式上機(jī)檢測(cè)。EdU陽(yáng)性細(xì)胞群為增殖細(xì)胞,細(xì)胞增殖抑制率即為EdU陽(yáng)性細(xì)胞占比。
1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表達(dá) 提取20、40、80 μmol/L濃度GANT61及0.5 μmol/L濃度SAG處理24 h后的細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),所用引物及其序列見(jiàn)表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。
表1 引物名稱及序列
2.1不同時(shí)間處理組不同GANT61濃度EOMA細(xì)胞增殖抑制率比較 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GANT61處理濃度越大、作用時(shí)間越長(zhǎng),EOMA細(xì)胞的增殖抑制率越大,呈劑量及時(shí)間依賴性(P<0.05)。當(dāng)處理24 h時(shí),IC50值為79.42 μmol/L,選擇20、40、80 μmol/L藥物濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表2。
表2 不同時(shí)間處理組不同GANT61濃度EOMA細(xì)胞增殖抑制率比較
2.2不同處理組EOMA細(xì)胞增殖率比較 EdU染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著GANT61藥物濃度的增加,EOMA細(xì)胞增殖抑制率越大,呈計(jì)量依賴性(F=47.057,P=0.000)。0.5 μmol/L SAG干預(yù)處理可促進(jìn)細(xì)胞增殖,與對(duì)照組[GANT61(-),SAG(-)]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.819,P=0.004)。見(jiàn)圖1。
圖1 不同處理組EOMA細(xì)胞增殖率比較圖
2.3不同處理組Cyclin D1、PCNA表達(dá)水平比較 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)水平均隨GANT61干預(yù)濃度的增加而降低,差異顯著(F=15.788,P=0.004;F=19.324,P=0.002)。見(jiàn)圖2?。與對(duì)照組比較,SAG干預(yù)處理可提高Cyclin D1和PCNA的mRNA表達(dá)水平,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.250,P=0.035;t=2.978,P=0.041)。見(jiàn)圖2?。
?GANT61處理組;?SAG處理組
3.1Sonic Hedgehog信號(hào)通路是一條進(jìn)化高度保守的信號(hào)通路,其不僅能有效調(diào)控哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程,而且在調(diào)控細(xì)胞分化、增殖、血管生成等方面起重要作用。在正常生理或病理?xiàng)l件下,Sonic Hedgehog信號(hào)通路在血管生成中發(fā)揮重要作用。研究表明[11]Sonic Hedgehog信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤血管生成,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移:在肝細(xì)胞癌中Sonic Hedgehog抑制劑Vismodegib/GDC-0449可阻斷肝癌細(xì)胞中VEGF的產(chǎn)生,導(dǎo)致血管密度下降,血管生長(zhǎng)減少,抑制腫瘤生長(zhǎng)。Hong等[12]研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌中Sonic Hedgehog信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1激活Sonic Hedgehog信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌中淋巴管生成蛋白、VEGF-C和VEGFR3表達(dá)。另外,Huaitong等[13]研究發(fā)現(xiàn)口腔癌細(xì)胞釋放的微泡通過(guò)Shh信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。目前,許多學(xué)者致力于靶向Sonic Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵組分研究開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物[14],已有兩種抑制劑LDE225/Sonidegib和GDC-0449/Vismodegib獲得美國(guó)食品藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn),用于治療基底細(xì)胞癌[15],同時(shí)大量靶向Sonic Hedgehog信號(hào)通路的抗腫瘤藥物也處于臨床試驗(yàn)中?;赟onic Hedgehog信號(hào)通路對(duì)腫瘤血管生成的調(diào)控作用,通過(guò)靶向Sonic Hedgehog信號(hào)抑制血管生成或許可為抗血管生成提供理論依據(jù)。
3.2血管瘤是嬰幼兒時(shí)期最常見(jiàn)的良性軟組織實(shí)體腫瘤,盡管大多數(shù)血管瘤為可自行消退的自限性疾病,但其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),破壞周圍組織,且部分患者由于腫瘤處于快速增生期或位于重要部位,可導(dǎo)致瘤體破潰、出血、功能損害等嚴(yán)重并發(fā)癥,引起生理功能障礙,甚至危及生命,所以血管瘤在一些情況下又具有部分惡性腫瘤進(jìn)程的特點(diǎn)[16]。目前,有關(guān)血管瘤的發(fā)病機(jī)制并不明晰,進(jìn)一步深入研究血管瘤自行消退機(jī)制,對(duì)血管瘤的早期診斷及治療具有重要意義。近年國(guó)內(nèi)外研究[17-18]發(fā)現(xiàn)在增殖期血管瘤中可見(jiàn)Sonic Hedgehog信號(hào)通路配體蛋白Shh、轉(zhuǎn)錄因子Gli2及其靶基因FOXA2表達(dá)上調(diào),Sonic Hedgehog信號(hào)通路異常激活,但Sonic Hedgehog信號(hào)通路在調(diào)控血管瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制及調(diào)控Sonic Hedgehog信號(hào)通路對(duì)血管瘤細(xì)胞生物學(xué)功能作用的文獻(xiàn)報(bào)道較少。
3.3EOMA細(xì)胞是小鼠血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞,為血管瘤研究常用細(xì)胞模型。本研究結(jié)果顯示Sonic Hedgehog信號(hào)通路抑制劑GANT61可抑制EOMA細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間及劑量依賴性,而Sonic Hedgehog信號(hào)通路激活劑SAG可促進(jìn)EOMA細(xì)胞增殖。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)GANT61干預(yù)作用后,EOMA細(xì)胞的增殖相關(guān)基因PCNA及Cyclin D1表達(dá)下調(diào),且呈劑量依賴,而SAG干預(yù)可上調(diào)PCNA及Cyclin D1的表達(dá)。表明Sonic Hedgehog信號(hào)通路在EOMA細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用,特異性抑制該信號(hào)通路可抑制EOMA細(xì)胞增殖,這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果相似,其機(jī)制可能為Sonic Hedgehog信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控PCNA及Cyclin D1參與細(xì)胞增殖,但是否通過(guò)調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖來(lái)調(diào)節(jié)血管生成具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,調(diào)控Sonic Hedgehog信號(hào)通路活性可影響血管瘤細(xì)胞增殖,提示Sonic Hedgehog信號(hào)通路可能參與了血管瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,這可能為血管瘤的診治方法提供了新的思路方向。但本研究未能在臨床組織樣本中檢測(cè)血管瘤患者中Sonic Hedgehog信號(hào)通路其他關(guān)鍵組分的表達(dá)情況,也未涉及動(dòng)物水平的體內(nèi)研究,研究結(jié)論及具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。