檸檬酸發(fā)酵液中有機酸含量HPLC 法測定

滿 云

（蚌埠學院 食品與生物工程學院，安徽 蚌埠233030）

1 引言

檸檬酸是生物體內主要的代謝產物之一。1913年首次報道黑曲霉能生成檸檬酸，檸檬酸生產的方法由提取法變?yōu)榘l(fā)酵法，檸檬酸為三羧酸循環(huán)過程中的中間產物［1］（P229-230）。 檸檬酸發(fā)酵液中的其他有機酸主要包括谷氨酸、葡萄糖酸、草酸、蘋果酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、α-酮戊二酸、丁二酸、富馬酸、烏頭酸和衣康酸等［2］（P65）。 有機酸含量過多，會影響檸檬酸的純度，降低檸檬酸轉化率。

目前對有機酸含量的檢測方法很多［3］［4］（P121）［5-6］，高效液相色譜技術應用于有機酸的含量檢測也有很多報道［7-14］，但已有的報道中測定的有機酸品種有限，同時測定多種有機酸的報道不多。 本實驗利用高壓液相色譜同時測定檸檬酸發(fā)酵液中的有機酸，通過選擇適合的流動相pH 值、流速、柱溫、檢測波長等，擬建立準確可靠、簡潔快速有效的檢測方法，同時分析檸檬酸發(fā)酵液中的12 種雜有機酸，以期為檸檬酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供了理論依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 供試材料和試劑

檸檬酸發(fā)酵液， 中糧生化檸檬酸生產線提供；乙腈（色譜純），美國Tedia 公司生產；谷氨酸、葡萄糖酸、草酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）、富馬酸（延胡索酸）、烏頭酸、衣康酸、檸檬酸標準品，百靈威科技有限公司生產。

2.2 儀器與設備

1200 安捷倫色譜儀；Diamonsil C18 （4.6 mm×250 mm）；檢測器：PDA 檢測器。

2.3 試驗方法

2.3.1 標準酸混合液的配制

表1 混合標準液的配制 g/100 mL

因雜酸含量不定，為定量準確，配制多級混合標準液。 標準液采用蒸餾水配制，用0.22 μm 的濾膜過濾。 混合標準如表1 所示。

2.3.2 各種有機酸的定性和定量

（1）定性用各種有機酸的單一標準液分別進樣，記下保留時間。

（2）定量用五級混合標準液，做標準曲線定量。

2.3.3 色譜條件

色譜柱 Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm）；流動相為0.1%磷酸溶液∶乙腈=96.5%：3.5%； 流速0.50 mL/min；檢測器PDA 檢測器；檢測波長210 nm；柱溫 25 ℃；進樣量 10 μL。

2.4 樣品前處理

取檸檬酸發(fā)酵清液，稀釋10 倍，用0.22 μm 的濾膜過濾后進樣分析。

3 結果與分析

3.1 色譜分離條件的確定

3.1.1 色譜柱的選擇

針對有機酸組系，C18 柱在色譜應用中是應用最為廣泛的色譜柱，故選擇C18 柱分析。

3.1.2 流動相的選擇和配制

（1）磷酸為 0.1%，pH 為 2.0，分離度較好；

（2）用0.1%磷酸與乙腈混合溶液作為流動相，調整磷酸溶液與乙腈的比例分別為90:10、93:7、96:4 和99:1 進行預實驗，選好比例范圍，再細化流動性配制比例，確定96.5:3.5 為流動相最佳配比。

3.1.3 檢測波長的選擇

將各種檢測用標準酸在200～254 nm 吸光度下進行PDA 掃描，各酸在210 nm 左右均有較大吸收峰，確定適宜檢測波長是210 nm。

3.1.4 進樣量的選擇

用標準有機酸混合液按 5 μL 和10 μL 的進樣量進行適宜進樣量比較分析，發(fā)現(xiàn) 5 μL 進樣量時，峰形較小，10 μL 進樣量時，峰形適中。

3.1.5 流速的選擇

分別以流速 0.4 mL/min、0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min 和 1.0 mL/min 進樣分析。流速為0.4mL/min、0.5 mL/min 和0.6 mL/min時分離效果較好。 流速高，峰分離度差；流速低，分析時間長， 柱效差。 綜合分離度和柱效， 確定0.5 mL/min 流速為最佳流速。

3.1.6 柱溫的選擇

根據(jù)色譜理論［4］，柱溫是影響柱效和分離度的主要因素。柱溫升高可以降低流動相的粘度和提高樹脂的傳質效率，但是溫度過高，不利于色譜柱的維護；同時，分析時間過短，也不利于分離。 因此，在0.5 mL/min 的流速下， 依次升高柱溫至20℃、25℃、30℃和35 ℃時，發(fā)現(xiàn)柱溫為25 ℃時分離效果較好。

3.2 檸檬酸發(fā)酵液中各種有機酸的定性與定量

3.2.1 有機酸的定性

分別用單一標準進樣，用保留時間給各有機酸定性（見表 2）。

表2 12 種有機酸標準品保留時間

3.2.2 有機酸的定量

利用外標法對檸檬酸發(fā)酵液中的有機酸進行定量。 利用五級混合標準液做標準曲線，以各有機酸對照品質量濃度X 對峰面積進行線性回歸，相關性R2均大于0.999，色譜圖見圖1 和圖2。

圖1 有機酸混標色譜圖

圖2 檸檬酸發(fā)酵液中有機酸液相色譜圖

3.3 重現(xiàn)性和回收率

3.3.1 重現(xiàn)性

將檸檬酸發(fā)酵液重復進樣5 次，低含量雜酸的重現(xiàn)性如表3。

表3 方法的重現(xiàn)性實驗結果

從表3 可以看出，除了富馬酸、衣康酸幾個痕量數(shù)據(jù)外，各有機酸含量的相對標準偏差（RSD）在0.32%～4.16%之間，重復性較好。

3.3.2 方法的回收率

在檸檬酸發(fā)酵清液中加入各種固體標準酸適量，超聲混勻，進行高效液相色譜法測定，加入量和檢出量的計算回收率結果如表4。

表4 回收率的統(tǒng)計

從表4 可以看出，有機酸發(fā)酵液中各有機酸加標回收率為96.22%~105.00%，方法的準確度較高。

3.4 檸檬酸發(fā)酵液中各有機酸含量的測定結果

按照前文樣品前處理和色譜分離條件，準備測試樣品和設置色譜條件。 測定生產菌（SC）在不同溫度條件下的發(fā)酵，其他工藝條件相同時，發(fā)酵終點液中的有機酸含量測定結果見表5。

表5 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵終點液中有機酸含量 g/100 mL

由表5 可以看出，發(fā)酵溫度越高，檸檬酸產酸越低， 谷氨酸等其他雜酸越高， 根據(jù)每種雜酸的變化趨勢， 還可以進一步分析代謝過程的關鍵控制點。

測定不同菌種在不同溫度下的發(fā)酵，例如出發(fā)菌（CF）和誘變菌（YB），發(fā)酵終點液中主要雜酸含量的測定結果見表6。

表6 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵終點液中主要有機酸含量 %

由表6 可以看出，谷氨酸等其他雜酸含量隨著溫度的升高有明顯升高。 同時，經(jīng)過誘變的耐高溫菌株，在高溫發(fā)酵的時候，谷氨酸等雜酸含量有明顯降低。 結果表明，HPLC 分析有機酸的方法，可以為菌種、發(fā)酵條件及發(fā)酵過程分析提供數(shù)據(jù)支持。

4 結語

本文采用HPLC 法測定檸檬酸發(fā)酵液中的12種有機酸雜質含量， 色譜柱為Diamonsil C18 （4.6 mm ×250 mm）， 流動相為 0.1%磷酸溶液： 乙腈=96.5%∶3.5%， 流速為 0.50 mL/min， 檢測器為 PDA檢測器，檢測波長為210 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL。 該方法測得的各有機酸相對標準偏差為0.32% ~ 4.16%，加標回收率為96.22% ~ 105.00%。該方法簡便快速、選擇性好、準確度高，可適用于檸檬酸不同發(fā)酵時間點的數(shù)據(jù)監(jiān)控，也可用于監(jiān)控指導檸檬酸后續(xù)提純過程。