乳脂分離與檢測分析技術研究進展

李墨翰 ，宋婉瑩 ，于海坤，劉愛成，張秀敏，張 娟，鄭 艷，岳喜慶

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，沈陽110161；2.北京食品科學研究院，北京100068）

脂質(zhì)為一類疏水性或兩性小分子，也是組成生物有機體最主要的成分之一。生物體內(nèi)的各種生物過程都會導致脂質(zhì)發(fā)生變化，如細胞增殖與凋亡、內(nèi)外環(huán)境變化等[1]。反之，脂質(zhì)的變化也會涉及與影響各種生物過程：例如脂質(zhì)參與能量代謝、組成生物膜結構、以及作為信號分子參與信號通路的調(diào)控。哺乳動物細胞中含有超過一萬種脂質(zhì)[2]；血液中的代謝物大部分為脂質(zhì)[3]。根據(jù)脂質(zhì)基本骨架的差異，可將脂質(zhì)分成八類，包括聚酮（polyketides，PK）、糖脂（saccharolipids，SL）、烯醇脂（prenol lipids，PR）、甾醇脂（sterol lipids，ST）、鞘脂（sphingolipids，SP）、甘油磷脂（glycerophospholipids，GP）、甘油脂（glycerolipids，GL）、脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）[4]。要全面研究脂類在分子生物學中的作用和功能，就必須對脂類進行準確的鑒定和定量。近年來，隨著脂質(zhì)組學（lipidomics）技術的發(fā)展，大通量地對脂質(zhì)進行表征與鑒定已經(jīng)成為可能。脂質(zhì)組學是使用大規(guī)模的高精度、高通量、快速的分析和檢測技術方法，揭示揭示生物體內(nèi)脂質(zhì)的多樣性及其對生理功能與代謝調(diào)控的影響[5]。早在21世紀初，脂質(zhì)組學的概念便由HAN等[6]發(fā)明，其發(fā)明的基于質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）的鳥槍法（shotgun）脂質(zhì)組學采用直接注入法將脂質(zhì)輸入質(zhì)譜，從而對脂質(zhì)進行鑒定。隨后出現(xiàn)了基于高分辨率質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集的直接輸注法，無需任何色譜分離即可直接完成脂質(zhì)的鑒定和定量[7]。

乳中含有2%～5%的脂質(zhì)。作為乳中主要的能量來源，乳脂能夠提供哺乳動物新生兒所需能量的50%以上[8]。乳脂由乳腺上皮細胞分泌并以乳脂肪球的形式分散在乳中，其中大部分乳脂以甘油脂的形式存在于乳脂肪球內(nèi)部（約98%），其余的小部分脂質(zhì)（約2%），如甘油磷脂、鞘脂、糖脂等則主要分布在乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）上[9]。乳脂中甘油磷脂的總量很低（約0.4%～1%），但其對于促進哺乳動物新生兒的神經(jīng)、大腦、視覺、腸道的發(fā)育具有不可或缺的意義，同時對于保持MFGM的結構也有不可或缺的作用[10]。目前鑒定到的乳脂主要包括大部分的甘油脂，以及少量的甘油磷脂、鞘脂、糖脂、甾醇脂等，乳中的甘油脂主要包括單甘脂（monoacylglycerol，MG）、甘油二酯（diacylglycerol，DG）、甘油三酯（triacylglycerol，TG）；乳中的甘油磷脂主要包括甘油磷脂酰膽堿（glycerophosphatidylcholine，PC）、甘油磷脂酰乙醇胺（glycerophosphatidylethanolamine，PE）、甘油磷脂酰甘油（glycerophosphatidylglycerol，PG）、甘油磷脂酸（glycerophosphatidic acid，PA）、甘油磷脂酰肌醇（glycerophosphatidylinositol，PI）、甘油磷脂酰絲氨酸（glycerophosphatidylserine，PS）、心磷脂（cardiolipin，CL）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）等脂質(zhì)；乳中的鞘脂主要包括神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、己糖神經(jīng)酰胺（hexosylceramide，HexCer）、二己糖基神經(jīng)酰胺（dihexosylceramide，Hex2Cer）等脂質(zhì)。研究表明乳脂含有上千種脂質(zhì)，是自然界脂質(zhì)組成最復雜的物質(zhì)之一。但是由于乳脂組成的復雜性以及脂質(zhì)結構鑒定的困難性，目前僅在乳脂中鑒定出500余種脂質(zhì)，仍有大量的乳脂有待表征與進一步鑒定[11]。因此，本研究綜述了乳脂質(zhì)組學常用的分離方法、檢測與分析平臺，以及適用于乳脂質(zhì)組學的生物信息學分析途徑，為深入研究乳脂質(zhì)營養(yǎng)及配方乳粉的精細化研究提供理論基礎。

1 乳脂的分離方法

20 世紀50 年代，F(xiàn)OLCH 等[12-13]分別建立了兩種使用氯仿-甲醇作為有機相的液-液萃取法用于提取脂質(zhì)，F(xiàn)olch 法適用于少量或組織中脂質(zhì)的提取，提取率大約在95%～99%；而Bligh 法適用于大量脂類的提取，提取率大約在95%。上述兩種方法是乳脂提取中使用最為廣泛的方法，其操作簡便，提取率較高。隨后，MATYASH 等[14]發(fā)明了甲基叔丁基醚法用以脂質(zhì)提取，LO¨FGREN 等[15]發(fā)明了使用丁醇提取脂質(zhì)的方法。此外，固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）、超聲輔助提?。╱ltrasonic-assisted extraction，UAE）、微波輔助提取（microwave-assisted extraction，MAE）、和超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SFE）也廣泛用于乳脂的提取，并可實現(xiàn)乳脂的進一步分離及低豐度脂質(zhì)進行選擇性富集。然而，由于脂質(zhì)分子結構復雜、種類繁多，當前的一些提取方法都很難完全提取脂質(zhì)。在提取前可采取添加內(nèi)標的方法，以定量分析和監(jiān)測回收率。

1.1 甘油脂

甘油脂亦稱甘油酯，指由甘油和脂肪酸（包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸）經(jīng)酯化所生成的酯類，為中性脂。薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）為乳脂質(zhì)組學研究領域中較為常用的脂質(zhì)分離方法。TLC 法是一種使用吸附薄層色譜來達到分離目的的方法[16]。該方法使用硅膠作為吸附劑，以正己烷，乙醚和乙酸（或甲酸）為流動相進行萃取，操作較為簡便且提取效率較高[17]，但是對于后續(xù)甘油脂的定量分析較為困難。

反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatographic，RP-HPLC）也是乳中甘油脂分離的常用方法，主要包含極性流動相與非極性固定相[18]。由于甘油脂是弱極性化合物，幾乎不溶于水，因此有機溶劑可增加甘油脂的溶解度。目前，適用于乳脂分析中RP-HPLC 的最常用的有機溶劑是丙酮和乙腈，最常用的固定相是十八烷基鍵合硅膠柱[11]。通過RP-HPLC分析甘油脂的峰，以碳原子當量數(shù)的順序洗脫。該方法制備的色譜主柱效高、使用壽命長、重現(xiàn)性好，對于乳中的甘油脂呈現(xiàn)良好的選擇性，同時能夠應用于梯度洗脫操作，在一定程度上彌補分配色譜法的缺陷[11]。

高效液相色譜結合銀離子交換柱（silver-ion high-performance liquid chromatographic，silver-ion HPLC）是分離乳脂中TG 異構體的最有效的色譜方法。采用silver-ion HPLC 方法時，TG 根據(jù)其組成脂肪酸的不飽和度從而進行分離，并且甘油三酯中雙鍵的數(shù)目越大，保留時間越長[19]。乳脂中甘油三酯的分離順序為：SSS、SSM、SMM、SSD、MMM、SMD、MMD、SDD、SST、MDD、SMT、MMT、DDD、SDT、MDT、DDT、STT、MTT、DTT、TTT（S、M、D和T 分別指飽和、單不飽和、包含兩個雙鍵以及包含3 個雙鍵的脂肪酸）[20]。分離出的TG 異構體的峰順序是：SMS、SSM、SMM、MSM、SDS、SSD、DSD、DDS、DMD、DDM[20]。

氣相色譜（gas chromatography，GC）具有較高的穩(wěn)定性和良好的準確性，但對于乳脂的分析僅適用于脂肪酸飽和度較高的樣品。乳中較高不飽和度的TG 在高溫下氧化裂解，相應的出峰順序按照TG 的碳總數(shù)從小打大進行排列。目前，針對甘油脂的分析主要使用兩種類型的填充劑，即非極性和中極性填料；前者可獲得不同的碳總數(shù)TG，后者可針對單一TG種類進行鑒定。針對乳中甘油脂的分析常用的色譜柱為WCOT柱，即為涂有25M×0.25mM甲基苯基硅氧烷聚合物的熔融石英。乳脂中甘油三酯的分離順序為：SSS、SSM、SSD、MMM、SDM、MMD、SDD、MDD、DDD、DDT[20]。

超臨界流體色譜法（supercritical fluid chromatography，SFC）也是脂質(zhì)分離較為常用的方法之一。與HPLC法相比，SFC 法的柱效更高，因此分離時間也比HPLC 法短。這是因為流體的低粘度使其流動速度比HPLC 法快，因此有效地縮短了分離時間。與GC法相比，由于流體的擴散系數(shù)與粘度介于氣體和液體之間，因此SFC的譜帶展寬更小小。另外，SFC 法的應用溫度比GC 法更低，對于熱不穩(wěn)定性化合物及高聚物的分離更為有效。對于乳中甘油三酯的分離，SFC 法可以使用與GC 法相同的色譜柱，并可以添加一定的改性劑以實現(xiàn)更好的分離度，從而實現(xiàn)對于甘油三酯同分異構體的分離與鑒定。乳脂中TG 的分離順序為：SMD、MMM、SDD、MMD、MMT、MDD、DDD、MDT、MTT、DDT、DTT[20]。

1.2 甘油磷脂

甘油磷脂指甘油的兩個羥基和脂肪酸形成酯，第3個羥基被磷酸酯化所形成的的脂類，為極性脂。TLC 法是用于甘油磷脂分離的最早的方法之一，其操作簡單快捷、對于磷脂純度的要求較低，目前仍廣泛應用于乳中甘油磷脂的分離。高效薄層色譜法（high performance thin layer chromatography，HPTLC）是對傳統(tǒng)TLC法的升級和改進，也更適用于磷脂的分析[21]。HPTLC 法的固定相使用更加細密均勻的改性硅膠（modified silica gel）及纖維素，所選擇的分離薄板的厚度也更低，因此相比于傳統(tǒng)的TLC法的分離時間更短、分離效果更好[22]。目前，采用HPTLC 法對于磷脂的分離所選擇展層劑多為氯仿/甲醇/水（25∶10∶1，V/V/V）[23]。由于HPTLC 法的樣品與空氣接觸時間較長、接觸面積較大，因此容易造成磷脂樣品的水解或氧化，同時靈敏度與分辨率也較低。

固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）也是廣泛應用于甘油磷脂的分離提取與富集的一種方法。相比于傳統(tǒng)的液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和蛋白沉淀法（protein precipitation，PPT），SPE 法所處理樣品的批量更大、靈敏度更高，同時效率更高，重現(xiàn)性也較好[24]。BANNI 等[25]采用SPE 法使用氨基固相萃取柱（amino solid phase extraction column，ASPEC）對甘油磷脂進行分離，但發(fā)現(xiàn)使用ASPEC 存在部分甘油磷脂分子共洗脫的現(xiàn)象，且PI無法進行洗脫。PéREZ-PALACIOS等[26]在ASPEC基礎上增加了PS、PE、PC的洗脫機體積，并進一步替換了PI的洗脫溶劑，最終鑒定到PI、PS、PE、PC共計4類甘油磷脂。

親水作用高效液相色譜法（hydrophilic interaction high-performance liquid chromatography，HIHPLC）能夠較好地實現(xiàn)親水性物質(zhì)與極性物質(zhì)的分離，也是甘油磷脂分離較為常用的方法之一。HIHPLC 法所使用的梯度和反相模式相反，其初始條件包括高比例有機相（如95%乙腈），并逐步降低到水相[27]。HIHPLC 法所使用的流動相與前面所描述的RP-HPLC 相似，與質(zhì)譜的兼容性更好。同時，由于HIHPLC 法所使用的流動相為與水互溶的有機溶劑，因此也很好地改善了RP-HPLC存在的極性物質(zhì)流動性差以及重現(xiàn)性較低的問題[28]。針對乳中甘油磷脂的分離，可使用氰基鍵合相（cyano bonded phase）、二醇基鍵合相（glycol bonded phase）、氨基鍵合相（amino bonded phase）、硅膠固定相（silica gel stationary phase）等與RP-HPLC 法所使用的的相同的固定相，也可以使用兩性離子固定相（zwitterionic stationary phase）、醇羥基固定相（alcohol hydroxyl stationary phase）、酰胺固定相（amide stationary phase）等HIHPLC專用的固定相[29]。

1.3 鞘脂與糖脂

鞘脂類分子由3 個基本結構成份組成：一是鞘氨醇，是長鏈的帶有氨基的二醇，鏈長約18 個碳原子；二是長鏈脂肪酸，鏈長約18～26 個碳原子，以酰胺鍵與鞘氨醇相結合，稱為神經(jīng)酰胺；三是極性基團的頭部，通常聯(lián)接在鞘氨醇第一個碳原子的羥基上。因極性基團不同，形成不同類型的鞘脂，含有磷酸的稱為鞘磷脂，含有糖基的稱為鞘糖脂。鞘糖脂分子中的糖基數(shù)目不等。僅含一個糖基的鞘糖脂統(tǒng)稱腦苷脂。與甘油脂、甘油磷脂的檢測方法類似，TLC 法也是最早應用于鞘脂及糖綴合物的定性分離檢測[30]。對于鞘脂與糖脂的分析，TLC 法使用高濃度的酸和其他腐蝕性彩色顯影劑進行顯色，并具有設備結構簡單、操作步驟方便、膨脹率高和分辨率高的優(yōu)點，并且可以使用糖脂特異性顯色試劑和抗體進行分離。在完成色譜分離后，也很容易消除非糖脂化合物的干擾并實現(xiàn)特異性檢測。但是TLC 法對于某些復雜的鞘脂類物質(zhì)的分離效果并不理想。相比于傳統(tǒng)TLC法，HPTLC法所使用的基質(zhì)硅膠顆粒具有更小的粒徑和更好的均勻性，因此更適合于鞘脂與糖脂的分離檢測[31]。為克服吸光度帶來的影響，HPTLC法采用多級膨脹技術，并利用更小的基質(zhì)硅膠顆粒增加單位面積樣品的濃度，從而提高檢測靈敏度[32]。HPTLC 法與質(zhì)譜技術相結合有效地解決上述問題，采用HPTLC-MS 法可直接對脂質(zhì)進行分離定量而無需進行純化[33]。

正相高效液相色譜法（normal phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC）可以實現(xiàn)鞘脂及糖脂等脂質(zhì)的分離，但由于流動相的易揮發(fā)、難溶等特特點，因此容易造成保留時間的漂移，從而減低質(zhì)譜的霧化效率[34]。于NP-HPLC 相比，RP-HPLC 法對于鞘脂與糖脂的分析更顯遜色。RP-HPLC 在對鞘脂、糖脂等脂質(zhì)進行分離檢測時易出現(xiàn)分離度較差及峰重疊的問題，并在MS中導致離子抑制[35]。

HIHPLC 法能夠較好地實現(xiàn)親水性物質(zhì)和極性物質(zhì)的分離，因此常用與鞘脂、糖脂、甘油磷脂等物質(zhì)的分離檢測。與前面所描述的針對甘油磷脂的分離相同，針對鞘脂、糖脂等脂質(zhì)時，HIHPLC 法硅膠為基質(zhì)鍵合親水性聚合物作為固定相，包括長鏈醚基（long chain ether groups）、聚酰胺（polyamide）、苯基（phenyl）、羥丙基（hydroxypropyl）、芐基（benzyl）等[36]。OKAZAKI等[37]采用HIHPLC法實現(xiàn)了甘油磷脂、鞘脂、糖脂等脂質(zhì)的分離及檢測，并對所鑒定到的100多種脂質(zhì)的二級結構進行了進一步分析。

2 乳脂的檢測及分析方法

2.1 電噴霧電離質(zhì)譜法

電噴霧電離質(zhì)譜法（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）是一種廣泛使用的軟電離方法。在這種方法中，包含分析物的洗脫液通過高壓針頭噴射，然后將帶電的液滴加熱以蒸發(fā)溶劑，最后分析物形成氣相離子以進行檢測和分析[38]。根據(jù)原理的差異，ESI-MS法可分成3類：ESI-MS直接定量法、ESI-MS/MS定量法和HPLC-ESI-MS定量法[39]。FENN等[40]最先將ESI-MS法應用于大批量混合物的分析，這種方法可以使生物分子離子化而不會發(fā)生碎裂，有助于更好地分析混合物的樣品。與其他方法相比，ESI-MS法具有預處理簡單、分離度高和易于自動化操作的優(yōu)點[43]。ESI法適用于極性、熱力學穩(wěn)定、非揮發(fā)性分子的分析，可以滿足大多數(shù)脂質(zhì)分析的要求，也適用于一些脂質(zhì)混合物（例如甘油磷脂和混合物）的定性和定量分析。

鳥槍法脂質(zhì)組學是由HAN 等[6]在ESI 法和三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜（triple quadrupole tandem mass spectrometry）的基礎上發(fā)明的。三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜由3個四極質(zhì)譜分析儀串聯(lián)在一起，其中第1個（Q1）和第3個（Q3）四級質(zhì)譜通常用作質(zhì)量分離，而第2 個四極（Q2）質(zhì)譜則通常用作作碰撞激活解離（collision-activated dissociation，CAD）的碰撞池。通過調(diào)整3 個四極桿的功能，可以實現(xiàn)產(chǎn)物離子掃描、前驅(qū)體離子掃描（precursor ion scan，PIS）、中性損失掃描（neutral loss scan，NLS）和選擇性反應監(jiān)測、多反應監(jiān)測等選擇功能[42]?；贓SI-MS/MS 的鳥槍法脂質(zhì)組學技術具有準確度高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、無需對復雜樣品進行預處理等優(yōu)點，在脂質(zhì)組學研究中得到廣泛應用。隨后，YANG 等[43]在2009年開發(fā)了基于多維質(zhì)譜的鳥槍法脂質(zhì)組學（multidimensional mass spectrometry-based shotgun lipidomics，MDMS-SL），并又于 2019 年提出了色譜分離質(zhì)譜法[44]。SOKOL 等[45]使用鳥槍法脂質(zhì)組學技術對人乳、牛乳和嬰兒配方乳粉中的脂質(zhì)進行了分析，共鑒定出6 類共計136 種脂質(zhì)，包括TG、PC、PE、PS、PI和SM，隨后SOKOL等[45]又采用GC法對乳脂中的脂肪酸進行補充研究，共表征并定量了16種碳原子數(shù)在10～20之間的脂肪酸?？紤]到乳脂基質(zhì)中包含數(shù)千種脂質(zhì)及大量的同分異構體，而色譜分離被認為是避免離子抑制和區(qū)分同分異構體的關鍵，因此鳥槍法常用于蛋白、多糖等生物大分子的研究，而對乳脂中大量脂質(zhì)的表征不夠全面。

2.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS）是脂質(zhì)組學方法常用的軟電離方法之一。MALDI-MS法通過將樣品與基質(zhì)混合并將激光能量通過基質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣品來測量分子的電離情況，同時，MALDI-MS 的離子源通常與飛行時間質(zhì)譜儀（time-of-flight mass spectrometer，TOF-MS）結合使用，該方法反應快速，方便可重現(xiàn)，并可以實現(xiàn)對高通量物質(zhì)的快速表征[53]，因此廣泛用于乳制品中的摻假鑒定[48]。GARCIA 等[49]使用MALDI-QTOF MS 實現(xiàn)了對牛乳粉及摻假牛乳粉中甘油脂的快速表征，最終鑒定到20 種TG；對羊乳及摻假羊乳中的磷脂進行快速鑒定，最終識別到5 類共計45 種磷脂，包括PC、LPC、PE、SM、PI[50]。盡管MALDI-MS 具有較高的靈敏度和分析通量，但在MALDI-MS 圖譜中通常無法找到質(zhì)子化后的磷脂分子[M+H]+。因此,MALDI-MS是鑒定某些脂質(zhì)種類中脂肪酸組成的較為快速與便捷的方法，但是對兩種不同類型的磷脂進行定量分析則較為困難[11]。同時由于MALDI-MS 電離模式受基質(zhì)的影響很大，因此必須找到合適的基質(zhì)來輔助樣品的電離，以實現(xiàn)更好的重現(xiàn)性和可比性。YENER 等[51]使用銀離子固相萃取與MALDI-TOF-MS 結合的方法，對無水牛乳及干法分餾獲得的不同熔點餾分中的甘油三酯進行表征，最終鑒定到81種甘油三酯；CALVANO 等[52]使用帶有二氧化鈦微柱的微固相萃取與MALDI-TOF-MS 結合的方法對牛奶、巧克力牛奶和黃油中的磷脂進行快速分析，最終鑒定出3類共計24種磷脂，包括SM、PC 和PE。因此,在使用MALDI-MS對乳脂進行表征時，最好選擇合適的基質(zhì)來輔助樣品的電離，從而實現(xiàn)更加準確的定性與定量。

2.3 核磁共振波譜法

核磁共振波譜法（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）也是乳脂質(zhì)組學指紋圖譜分析較為常用的方法。相比于其他方法，NMR 法可以直接提供樣品中某一特定原子的各種化學狀態(tài)或物理狀態(tài)，并可得到它們各自的定量數(shù)據(jù)，而這些數(shù)據(jù)并不需要純物質(zhì)的校正，譜帶下的面積直接與提供這種面積的原子核數(shù)量成正比。同時，NMR法可用于混合樣品的直接檢測，具有不破壞樣品及高重復性的優(yōu)點。BOCCIA等[53]使用NMR法對不同飼喂條件下山羊奶的脂肪酸組成進行了分析，并發(fā)現(xiàn)在山羊補充亞麻籽飲食后，其乳脂中共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的質(zhì)量濃度較高；TSIAFOULIS等[54]使用NMR法對普通牛奶和有機牛奶的乳脂進行對比分析，發(fā)現(xiàn)有機牛奶中的共軛亞油酸、α-亞麻酸等不飽和脂肪酸的含量顯著增加；KLEIN 等[55]對酮癥與健康奶牛的乳脂進行對比分析，發(fā)現(xiàn)乳中甘油磷酸膽堿與磷酸膽堿的比例可作為奶牛酮癥風險的生物標志物；GARCIA 等[56]采用NMR 法對不同乳源（牛乳、人乳、馬乳、駱駝乳）中的磷脂進行對比研究，共鑒定到12個亞類，包括LPA、LPE、PA、CL、磷脂酰乙醇胺縮醛磷脂（phosphatidylethanolamine plasmalogen，EPLAS）、PE、SM、PS、LPC、PI、烷基酰基磷脂酰膽堿（alkyl-acyl phosphatidylcholine，aaPC）、PC，并發(fā)現(xiàn)人乳和駱駝乳中鞘磷脂和縮醛磷脂的總含量較高。但是，NMR 法對于復雜化合物的定性及定量分析能力是有限的，因此其靈敏度與質(zhì)譜相比較差且通常應用于非選擇性分析。

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）是脂質(zhì)組學分析中較為常用且操作較為便捷的方法之一，大多數(shù)用于檢測揮發(fā)性化合物或可衍生成揮發(fā)性的化合物，在乳脂質(zhì)組學分析中常用與脂肪酸的檢測和分析。例如，本課題組使用基于GC-TOF-MS 的脂質(zhì)組學技術，對不同泌乳期驢乳的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）進行對比研究，共鑒定到24種FFA，并發(fā)現(xiàn)其中11種FFA的表達量存在顯著差異[57]；JONG等[58]使用GC-MS 對牛乳和奶酪中的FFA 進行分析，共鑒定到11 種FFA，包括10 種飽和FFA（C2∶0～C18∶0）和1種單不飽和FFA（C18∶1）；CHUANG 等[59]基于GC-MS法對母乳和嬰幼兒配方乳中的FFA進行對比研究，共鑒定到16 種FFA，包括8 種飽和 FFA（C10∶0～C24∶0），2 種單不飽和 FFA（C16∶1，C18∶1）和 6 種多不飽和 FFA（C18∶3n-3，C18∶2n-6，C20∶4n-6，C20∶5n-3，C20∶3 和 C22∶6n-3）。JAMES 等[60]最先將GC 法引入到脂肪酸的檢測中，并使用極性毛細管柱（如DB-Wax 或INNOWax）用于分析檢測。通過將質(zhì)譜連接到GC 作為其檢測器，能夠大幅提高檢測的靈敏度。GC-MS 作為脂質(zhì)組學分析的重要工具之一，具有良好的分離效率且價格相對低廉。GC-MS 分析前樣品制備的步驟通常包括脂質(zhì)的預分離、水解、衍生化或熱分解[61]。由于GC-MS 只能分析揮發(fā)性有機物，對于非揮發(fā)性脂質(zhì)，必須先用磷脂酶C（phospholipase C）水解后才能進行分析。水解后的產(chǎn)物通常包括FFA、水溶性產(chǎn)物（皂化部分）和一些非極性、非皂化的成分[62]。在衍生化的過程中，通常采用硅烷化或甲酯化的方式來提高脂質(zhì)的揮發(fā)性，以便進一步分析[63]。然而，在實際的GC-MS 分析過程中的脂肪酸為已經(jīng)酯化后的脂肪酸，因此無法獲得脂質(zhì)sn-1 和sn-2 ?；舅徭湹奈恢眯畔64]。另外，由于樣品衍生化過程不僅需要額外的時間，而且需要大量的樣品，樣品在這個過程中也極容易發(fā)生變化。由于上述這些問題，GC-MS法在實際應用中只用于相對簡單的脂肪酸的分析和鑒定，而較少用于對復雜脂質(zhì)分子及其結構的鑒定。

2.5 高效液相色譜-質(zhì)譜法

高效液相色譜-質(zhì)譜法（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是目前乳脂質(zhì)組學研究中使用最廣泛、靈敏度最高的研究方法，并常用與靶向及非靶向分析。在HPLC-MS 分析之前需要對脂質(zhì)進行提取，BLIGH 等[65-66]發(fā)明的方法是目前HPLC-MS分析中使用最廣泛的脂質(zhì)提取方法。另外也可以添加一些抗氧化劑，如丁基化羥基甲苯（butylated hydroxytoluene）等，可以避免脂質(zhì)在提取前的氧化[67]。在進行HPLC-MS 分析之前，通常使用蒸發(fā)的方式來除去萃取劑（氯仿/甲醇），并且在與LC 流動相適應的不同溶劑系統(tǒng)中重建脂質(zhì)[68]。為提高HPLC-MS 分析的準確性和靈敏性，通常在提取前添加包括每種亞類脂質(zhì)的內(nèi)標[69]。此外，為提高脂質(zhì)組學分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量并提高鑒定脂質(zhì)的數(shù)量，通常在HPLC-MS 分析之前使用SPE 色譜柱或TLC 對樣品進行預清洗或預分離[11]。可選擇的用于脂質(zhì)組學分析的脂質(zhì)分離的液相色譜有很多，包括銀離子液相色譜（silver-ion-LC）、手性液相色譜（chiral LC）、超臨界流體液相色譜（supercritical fluid LC）、離線二維液相色譜（off-line 2-D LC）、正相液相色譜（NP-LC）、反相液相色譜（RP-LC）和親水相互作用液相色譜（HI-LC）等。質(zhì)譜分析儀則主要包括四極桿-飛行時間（quadrupole-time of flight，Q-TOF）質(zhì)譜、串聯(lián)四級桿復合線性離子阱（series quadrupole composite linear ion trap，Q-Trap）質(zhì)譜、三重四級桿（triple quadrupole，QQQ）質(zhì)譜、傅立葉變換離子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)TICR）質(zhì)譜等。HPLC-MS 不僅可以確定乳脂的種類和每種脂種類的脂肪酸組成，在某些條件（不同的電離技術）下還可以確定脂肪酸的區(qū)域特異性位置，并提供有關脂質(zhì)類別和單個脂質(zhì)的定量信息[11]。與GC-MS 法相比，HPLC-MS 法更適用于對長鏈及較難揮發(fā)的脂質(zhì)的定性及定量分析；與NMR法相比，HPLC-MS法在定量及次級代謝物分析方面具有優(yōu)勢。本課題組使用基于UHPLC-QTOF-MS 的脂質(zhì)組學技術對不同泌乳期驢乳與牛乳進行研究，共鑒定到13 個亞類共計335 種脂質(zhì)，包括CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、Cers、SMs、HexCers、Hex2Cers、DG、TGs[70-71]；WANG 等[72]使用基于UHPLCQ-TOF-MS 的脂質(zhì)組學技術對人乳、牛乳和駱駝乳中的脂質(zhì)進行分析，共鑒定到13 個亞類的脂質(zhì)，包括TG、DG、SM、PC、Cer、HexCer、Hex2Cer、PE、PG、PS、PI、PA、CL；LIU 等[73]使用基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 的脂質(zhì)組學技術對不同泌乳期及產(chǎn)地的山羊乳進行對比分析，共鑒定到14個亞類共計756種脂質(zhì)，包括CL、Cer、LPC、LPE、PC、PE、PG、PI、脂酰肉堿（acyl carnitine，AcCa）、HexCer、SM、FA、DG、TG。

此外，大氣壓化學電離質(zhì)譜（atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry，APCI-MS）和新型的敞開式質(zhì)譜（Ambient MS）也較多地應用于脂類分析，然而由于乳脂組成的復雜性與現(xiàn)有技術的局限性，任何一種單一的分析方法都無法檢測所有的脂質(zhì)種類。但是，不同分析方法的結合可以較為有效地克服單一技術存在的局限性。

3 乳脂質(zhì)組學的生物信息學分析

3.1 脂質(zhì)分類與脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫

通過質(zhì)譜獲得的原始數(shù)據(jù)需要在統(tǒng)計分析之前先進行識別、標準化和歸一化等操作，最終才可以獲取用于脂質(zhì)組學分析的具體數(shù)據(jù)。許多國家和機構均建立了自己的脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫（表1）。

LMSD脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫是美國于2003年發(fā)起的“脂質(zhì)代謝和代謝途徑研究”項目的成果。該脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫根據(jù)脂質(zhì)基本骨架的差異將脂質(zhì)分為八類，分別為包括脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、烯醇脂、糖脂和聚酮。LMSD 脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫可鑒定超過168 萬種脂質(zhì)，并提供超過1 萬種脂質(zhì)的結構信息，其數(shù)據(jù)來源主要有：（1）LipidBank、LIPIDAT及其他脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫；（2）參與LMSD項目的實驗室及其合作者；（3）LMSD項目中通過試驗表征的脂質(zhì)；（4）從已知脂質(zhì)中提取分離得到的脂質(zhì)。LMSD 也是目前國際脂質(zhì)組學研究中使用最廣泛、脂質(zhì)信息最全、分類最權威的脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

3.2 脂質(zhì)組學分析軟件

近年來，隨著脂質(zhì)組學分析水平和檢測技術的大幅進步，一大批基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的脂質(zhì)組學分析軟件不斷涌現(xiàn)，并具有數(shù)據(jù)導入、質(zhì)譜過濾、峰檢測、色譜比對、標準化、可視化、多元統(tǒng)計分析、代謝通路分析、數(shù)據(jù)輸出等多種功能（表2）。脂質(zhì)分子通常要經(jīng)過脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索或軟件識別，并通常選擇內(nèi)標法進行脂質(zhì)的定量分析。首先對采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行同位素定標，然后分析內(nèi)標物和質(zhì)譜中各測試脂質(zhì)的信號強度。最后，根據(jù)兩者的比值計算出相應的比例。不同種類的脂質(zhì)在質(zhì)譜中的響應靈敏度不同，采用內(nèi)標法定量存在一定的偏差，但由于大多數(shù)研究反映了生物系統(tǒng)某一過程中脂類的變化，因此這種定量方法基本可以滿足大部分脂質(zhì)組學的研究要求。

以模式識別（pattern recognition，PR）為基礎的多元統(tǒng)計分析（multivariate statistical analysis，MSA）是目前脂質(zhì)組學生物信息學（bioinformatics）分析中常用到的方法[87]。PR 是數(shù)據(jù)中模式和規(guī)則的自動識別，可用于統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析、信號處理、圖像分析、信息檢索、生物信息學、數(shù)據(jù)壓縮、計算機圖形學和機器學習等領域[88]。目前，應用于脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析的PR主要包括無監(jiān)督模式識別（unsupervised pattern recognition，UPR）和有監(jiān)督模式識別（supervised pattern recognition，SPR）[81]。UPR 指為事先未假定訓練數(shù)據(jù)的標記與分組，利用降維處理的方式在數(shù)據(jù)中查找數(shù)據(jù)內(nèi)部的固有模式，然后用于確定其數(shù)據(jù)的分組情況、篩選生物標志物、或用于確定新數(shù)據(jù)

的正確輸出范圍等。常見的UPR 分析有主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等。SPR 與UPR 相反，指事先假定練數(shù)據(jù)的標記與分組，利用降維處理的方式在數(shù)據(jù)中查找數(shù)據(jù)內(nèi)部的固有模式，用以分組檢驗或生物標志物的篩選[89]。常見的SPR 分析有偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（orthogon partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等。在OPLS-DA 使用的同時也經(jīng)常伴隨使用置換檢驗（permutation validation），用以檢驗所使用的模型是否存在過擬合的現(xiàn)象[90]?？偠灾?，MSA 可用于鑒定脂質(zhì)代謝物與生理表型之間的關聯(lián)，并可有效地挖掘大量數(shù)據(jù)中的脂質(zhì)生物標志物。同時，MSA 還包括應用生物信息學技術來構建脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡，特別是與特定蛋白質(zhì)和基因相關的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡。然而由于脂質(zhì)成分及結構的復雜性，目前關于脂質(zhì)組學中代謝通路的分析軟件及方法仍有待開發(fā)。

表1 脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫Table 1 Database of lipidomics

表2 脂質(zhì)組學分析軟件Table 2 Analysis software of lipidomics

4 結論

隨著脂質(zhì)組學分析水平和檢測技術的發(fā)展，有關乳脂質(zhì)組學的研究與應用取得了大量令人矚目的成果，包括在脂質(zhì)分子水平上鑒定和定量了數(shù)百種人類和其他哺乳動物的乳脂，為嬰幼兒配方乳粉的研發(fā)提供了詳實的理論依據(jù)與豐富的數(shù)據(jù)支持。然而，目前脂質(zhì)組學仍存在一些技術難題亟待解決。首先由于脂質(zhì)結構的復雜以及數(shù)量眾多，因此較難所有的脂質(zhì)進行分離并檢測；其次，不同的脂質(zhì)的含量差異巨大，因此對脂質(zhì)分子的精確定量較為困難；同時，由于脂質(zhì)標準品較難獲得，因此也進一步限制了脂質(zhì)組學的定性與定量分析。另外，脂肪酸酰化位置異構、雙鍵位置異構、雙鍵立體異構也是目前脂質(zhì)組學研究中的熱點與難題。與此同時，將脂質(zhì)組學的數(shù)據(jù)信息與轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等多組學數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，以及不同的脂質(zhì)在分子水平上的生物學功能差異也將成為脂質(zhì)研究的重點。