豇豆多糖的超聲輔助提取條件優(yōu)化及體外抗氧化研究

楊 強(qiáng)，王 柱，蓋智涵，亓 鑫，王思宇，李拖平，李蘇紅

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽110161）

豇豆屬豆科類植物，在北方主要作為蔬菜食用，而在西北地區(qū)豇豆粉（又稱豆面）常做為主食。豇豆?fàn)I養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、纖維素和礦物質(zhì)等，具有抗氧化、延緩衰老、促進(jìn)腸道蠕動和調(diào)節(jié)血糖等作用[1-3]。近些年，植物多糖由于其天然無害、來源范圍廣且大多具有生理功能活性等特點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)，而豇豆多糖作為豇豆中主要活性成分之一，具有明顯的降血糖、降血脂等功效，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣闊的開發(fā)前景[4-5]。多糖提取方法常見的主要有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解法等[6-7]。熱水提取由于其安全操作和對環(huán)境的保護(hù)而常被視為是提取多糖的常用方法之一[8-9]。然而，其缺點(diǎn)是提取時間長以及多糖的產(chǎn)率低。因此，為提高豇豆多糖的得率，本研究擬采用超聲輔助法提取豇豆多糖，在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化豇豆多糖的提取工藝條件，并對提取的多糖進(jìn)行抗氧化活性評價，以期為豇豆深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豇豆粉購于山西興縣山花爛漫農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司；濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、95%乙醇、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,為分析純；2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)購于德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZB604C 型分析天平（沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司）；JHH6A 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）；R1002B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；CR21N 型高速冷凍離心機(jī)（日本HITACHI）；FDI-B50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；VCX-750型超聲波細(xì)胞破碎儀（美國Sanics）；SHZ-D型真空泵（浙江臺州求精真空泵有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 豇豆粗多糖提取工藝 豇豆粉→超聲輔助提取→離心收集上清→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→乙醇沉淀→冷凍干燥→粗多糖。

式中：m為粗多糖質(zhì)量(g)；m1為豇豆粉質(zhì)量(g)。

1.3.2 不同超聲輔助提取條件對豇豆多糖得率的影響 （1）不同超聲功率對豇豆多糖提取率的影響。固定料液比1∶30g·mL-1、提取時間2h、提取溫度90℃、超聲時間2min、在超聲額定功率的20%、30%、40%、50%、60%（額定功率750W）下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。（2）不同超聲時間對豇豆多糖得率的影響。固定料液比1∶30g·mL-1、提取時間2h、提取溫度90℃、超聲功率30%、在超聲時間2，3，4，5，6min下進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.3 豇豆多糖提取的單因素試驗(yàn) （1）提取溫度對豇豆多糖得率的影響。超聲功率50%、超聲時間5min、固定料液比1∶30g·mL-1、提取時間2h、在提取溫度為60，70，80，90，100℃下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。（2）提取時間對豇豆多糖得率的影響。超聲功率50%、超聲時間5min、固定料液比1∶30g·mL-1、提取溫度90℃，在提取時間1，1.5，2，2.5，3h 下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3 次。（3）料液比對豇豆多糖得率的影響。超聲功率50%、超聲時間5min、固定提取時間2h、提取溫度90℃，在料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50g·mL-1下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對提取工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。以提取時間（A）、提取溫度（B）和液料比（C）為考察的變量，以豇豆多糖的得率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，優(yōu)化超聲輔助提取豇豆多糖的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計見表1。

1.3.5 豇豆多糖體外抗氧化活性

1.3.5.1 豇豆多糖（CPP）對羥基自由基清除能力測定。1mL 多 糖 溶 液 +1mL FeSO4（9mmol· L-1）+1mL 水 楊 酸（9mmol·L-1）+1mL H2O2（8.8mmol·L-1），37℃水浴 30min，測OD510，以VC水溶液做參照，根據(jù)式（2）計算清除率。

式中：Ac為超純水代替樣品時的吸光度；Ai為加入樣品溶液后測得的吸光度；Aj為不同濃度樣品的本底吸光度。

1.3.5.2 豇豆多糖（CPP）對DPPH 自由基清除作用的測定。2.0mL 多糖溶液+2.0mL DPPH 溶液（無水乙醇配置），搖勻，30℃靜置30min，測OD517，以VC水溶液做參照，根據(jù)式（3）計算清除率。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

式中：Ac為超純水代替樣品時的吸光度；Ai為加入樣品溶液后測得的吸光度；Aj為不同濃度樣品的本底吸光度。

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力的測定。0.2mL ABTS儲備液（7.4mmol·L-1）+0.2mL K2S208（2.6mmol·L-1），混合避光12h 得到ABTS 陽離子溶液；用磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）稀釋ABTS陽離子溶液40～50倍，使其OD734為0.70±0.02，待用；100μL 不同濃度的多糖溶液+3.9mL ABTS 陽離子溶液，以VC水溶液做參照，25℃下避光10min，測OD734，根據(jù)式（4）計算清除率。

式中：Ac為超純水代替樣品時的吸光度；Ai為加入樣品溶液后測得的吸光度；Aj為不同濃度樣品的本底吸光度。

1.3.5.4 總還原力的測定。1mL 樣品+1mL PBS 緩沖液（0.2mol·L-1、pH 值 6.6）+1mL 鐵氰化鉀溶液（1g·100mL-1），震蕩均勻，50℃恒溫水浴 20min，+1mL 三氯乙酸（10g·100mL-1），4800r·min-1離心 5min，2mL 上清液+2mL蒸餾水+400μL三氯化鐵（0.1g·100mL-1），測OD700AX。用PBS代替待測樣品為A0，還原力表示為（A0-AX）/A0。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用Origin 8.5 繪制單因素試驗(yàn)圖表并制作誤差線，SPSS 21.0 對單因素數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計和分析，在相應(yīng)條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲輔助提取條件對豇豆多糖得率的影響

2.1.1 不同超聲功率對豇豆多糖得率的影響 熱水提取豇豆多糖的得率為1.35%，經(jīng)超聲處理后豇豆多糖的得率顯著升高，說明超聲作用有助于多糖的溶出。由圖1 可知，隨著額定功率增大到50%時，豇豆多糖得率出現(xiàn)峰值。其原因是隨著超聲功率的增加其對多糖結(jié)構(gòu)的作用力增加。豇豆粉吸收能量，導(dǎo)致溫度升高和內(nèi)部壓力升高，促進(jìn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，并使多糖溶解在溶劑中[10]。但是當(dāng)功率超過50%時，豇豆多糖的得率明顯下降。這可能是因?yàn)楣β蔬^大提供的能量過多，分子之間運(yùn)動劇烈破壞了一部分的多糖[11]。

圖1 超聲功率對豇豆多糖得率的影響Figure 1 Effect of ultrasonic power on the yield of cowpea polysaccharide

2.1.2 不同超聲時間對豇豆多糖提取率的影響 由圖2 可知，超聲時間從2min 增加到5min 時，隨著時間的延長，豇豆多糖的得率也增加。這可能是因?yàn)闀r間的增加，溶液中吸收的超聲波的能力增加，從而導(dǎo)致熱量聚集在一起，加快了多糖的傳質(zhì)速度，有利于超聲空化作用的產(chǎn)生，使得多糖從溶劑中析出。當(dāng)超聲時間超過5min，多糖得率呈現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因?yàn)榭栈饔玫臅r間增加導(dǎo)致多糖鏈被破壞，從而影響多糖的得率[12]。因此，在本試驗(yàn)中確定超聲功率為額定功率的50%，超聲時間5min。

2.2 豇豆多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.2.1 提取溫度對豇豆多糖得率的影響 由圖3 可知，在一定的時間下，隨著溫度的升高，豇豆多糖的產(chǎn)量增加，并在90℃達(dá)到最高。這是因?yàn)闇囟鹊奶岣邥黾臃肿娱g的運(yùn)動，加速細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)傳遞[13]。隨著溫度的升高，多糖的產(chǎn)率升高，原因可能是溫度的升高有利于多糖的溶解，進(jìn)而增加了多糖的得率。然而，當(dāng)溫度太高時一些多糖會分解，因此，多糖的產(chǎn)率會降低?？紤]到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的消耗以降低成本，選擇最佳提取溫度為90℃。

圖2 超聲時間對豇豆多糖的得率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on the yield of cowpea polysaccharide

圖3 提取溫度對豇豆多糖得率的影響Figure 3 Effect of extraction temperature on yield of cowpea polysaccharide

2.2.2 提取時間對豇豆多糖得率的影響 由圖4 可知，多糖的得率隨提取時間的延長而升高。當(dāng)提取時間達(dá)到2.0h時，多糖的產(chǎn)量達(dá)到峰值，但超過2.0h時，隨著提取時間的延長，多糖的得率下降，這可能是由于提取時間的延長導(dǎo)致了多糖的降解[14]，也可能是因?yàn)樘崛r間過長，多糖在提取后在高溫下部分被破壞或降解，從而導(dǎo)致多糖產(chǎn)量下降。溫度過高時，冷凍干燥的粗多糖的顏色為深棕色，需要進(jìn)行脫色處理。因此，提取時間選擇2.0h最適宜。

圖5 料液比對豇豆多糖得率的影響Figure 5 Effect of material liquid ratio on yield of cowpea polysaccharide

2.2.3 料液比對豇豆多糖得率的影響 由圖5 可知，當(dāng)料液比為1∶40 時，豇豆多糖的產(chǎn)量最高。這可能是由于原料與水的比例增加時，細(xì)胞內(nèi)部和外部的滲透壓也升高，從而加速多糖在溶液中的溶解速度，進(jìn)而提高豇豆多糖的得率[15]。然后，隨著料液比的繼續(xù)增加，多糖的得率隨料液比的增加而降低，這種結(jié)果的出現(xiàn)可能是因?yàn)樗c物質(zhì)的比例過大導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)外溶劑之間的濃度差異很大，過大的料液比會降低分子之間的相互作用，從而導(dǎo)致多糖產(chǎn)量下降[16]。

2.3 豇豆多糖提取工藝條件優(yōu)化

2.3.1 模型方程建立和顯著性分析 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件，建立提取時間、提取溫度及液料比三因子數(shù)學(xué)回歸模型為：

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface optimization test design and results

由表3 可知，一次項(xiàng)中，B（提取溫度）對多糖的得率的線性效果不顯著（p＞0.05），A（提取時間）對多糖的得率線性效果極顯著（p＜0.01），C（料液比）對多糖得率的線性效果顯著（p＜0.05）。二次項(xiàng)中，A2、B2、C2影響均極顯著（p＜0.01），AB顯著（p＜0.05），AC、BC影響不顯著（p＞0.05）。此模型顯著性檢測p值為0.0007，極顯著，失擬項(xiàng)p值為0.1848，不顯著。根據(jù)F值可知，各因素對多糖得率的影響大小依次為A（提取時間）＞C（液料比）＞B（提取溫度）。

2.3.2 交互作用影響結(jié)果 從等高線的形狀可以判斷兩個因素之間的交互作用是否顯著。如果輪廓的形狀近似于橢圓，則這兩個因素之間的相互作用是很明顯的。如果輪廓類似于圓形，則兩個因素之間的相互作用不明顯。由圖6 可知，AB，AC 和BC 的輪廓線幾乎是圓形的，這表明相互作用并不顯著，該結(jié)論與表3 的結(jié)果一致。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由圖6a可知，當(dāng)料液比固定時，提取溫度和提取時間對多糖得率的影響不顯著。從單因素的角度來看，提取時間對多糖得率的影響更大。當(dāng)提取溫度固定時，多糖含量隨提取時間的延長先升高后降低。由圖6b 可知，當(dāng)提取溫度固定時，提取時間與料液比之間的相互作用不顯著，并且從單一因素來看，提取時間對多糖得率的影響更大。當(dāng)料液比保持不變時，多糖的得率隨提取時間的延長先增加后降低。當(dāng)提取時間為90℃時，多糖的得率最高。當(dāng)提取時間保持不變時，多糖含量隨料液比的增加先增加后減少。料液比為1∶40 時，多糖得率最高。由圖6c可知，當(dāng)提取時間固定時，提取溫度與料液比之間的相互作用并不顯著，但從單因素角度來看，料液比對多糖得率的影響更大。當(dāng)提取溫度固定時，隨著料液比的增加，多糖得率先升高后降低。當(dāng)料液比為1∶40時，多糖的率達(dá)到最大。當(dāng)固液比固定時，隨著提取溫度的升高，多糖得率先升高后略有下降。提取溫度為90℃，多糖得率最高。

圖6 各因素交互作用對粗多糖得率等高線圖和響應(yīng)面圖Figure 6 Contour map and response surface of interaction of various factors on crude polysaccharide yield

2.3.3 最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.6模型預(yù)測了每個因素水平的最佳值：提取時間1.98h，提取溫度93.73℃，料液比42.44g·mL-1。多糖得率的理論值為7.70%。結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，對試驗(yàn)條件進(jìn)行如下調(diào)整：提取時間2.0h，提取溫度93℃，料液比1∶42。在此條件下，多糖得率為7.65%。多糖命名為CPP。

2.4 豇豆多糖體外抗氧化活性

2.4.1 豇豆多糖（CPP）對羥基自由基清除能力測定 羥基自由基被認(rèn)為是活性最強(qiáng)的自由基，也是毒性最大的自由基，輻射損傷等物理、化學(xué)因子都會促進(jìn)其形成，是造成生物有機(jī)體過氧化損傷的主要因素。由圖7 可知，在0～5mg·mL-1范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，豇豆多糖對·OH 的清除率也隨之增大。在其濃度為5mg·mL-1時清除率達(dá)到最高，為57%，而多糖的IC50為4.85mg·mL-1。

2.4.2 豇豆多糖（CPP）對DPPH 自由基清除作用的測定 由圖8 可知，在0～5mg·mL-1范圍內(nèi)，豇豆多糖具有清除DPPH 自由基的作用，且清除能力呈量效正相關(guān)。當(dāng)其濃度為5mg·mL-1時清除率可達(dá)75%。當(dāng)濃度為2.51mg·mL-1時達(dá)到羥基自由基清除能力的IC50。

圖7 豇豆多糖對羥基自由基的清除能力Figure 7 Effect of cowpea polysaccharide on the clearing ability of hydroxyl radicals

圖8 豇豆多糖對DPPH自由基的清除能力Figure 8 Effect of cowpea polysaccharide on the scaveng‐ing ability of DPPH flee radicals

圖9 豇豆多糖對ABTS自由基的清除能力Figure 9 Effect of cowpea polysaccharide on the scaveng‐ing ability of ABTS free radicals

圖10 豇豆多糖的還原力Figure 10 Reducing power of cowpea polysacch-aride

2.4.3 ABTS 自由基清除能力的測定 由圖9可知，在0～5mg·mL-1范圍內(nèi)，豇豆多糖對ABTS自由基清除力先升高后降低，當(dāng)豇豆多糖的濃度達(dá)到3mg·mL-1時，ABTS 自由基清除能力最高為78%。當(dāng)濃度為1.35mg·mL-1時達(dá)到ABTS自由基清除能力的IC50。以上說明豇豆多糖對ABTS自由基具有一定的清除能力。

2.4.4 還原力的測定 由圖10可知，在0～3mg·mL-1范圍內(nèi)，豇豆多糖的總還原力明顯增強(qiáng)；在3～5mg·mL-1范圍內(nèi)總還原力比較穩(wěn)定。當(dāng)豇豆多糖的濃度達(dá)到3mg·mL-1時，還原能力達(dá)最高為99.4%。當(dāng)濃度為1.61mg·mL-1時達(dá)到還原力的IC50。

3 討論與結(jié)論

馬鈴薯淀粉是一種應(yīng)用十分廣泛的植物淀粉，但在應(yīng)用方面仍存在一些缺陷，如對熱、酸和剪切力敏感等。大量研究表明，瓜爾膠、黃原膠、結(jié)冷膠和大豆多糖等非淀粉多糖都會對淀粉的性質(zhì)產(chǎn)生影響[17-20]。目前，關(guān)于豇豆多糖對馬鈴薯淀粉的影響尚未見報道。因此，本文通過對超聲波輔助提取豇豆多糖的最佳工藝參數(shù)的研究，為研究其對馬鈴薯淀粉理化性質(zhì)、糊化特性及流變特性的影響奠定基礎(chǔ)，為擴(kuò)寬豇豆多糖和馬鈴薯淀粉復(fù)配體系在食品行業(yè)的應(yīng)用提供新思路。