生理和環(huán)境因子對甜菜夜蛾性信息素釋放及其雄蛾嗅覺反應的影響

姜 策 ，孟 威，郭前爽，張素麗，王興亞，杜永均

（1.遼寧省綠色農(nóng)業(yè)技術(shù)中心，沈陽110034；2.浙江大學農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所,杭州310058；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽110161）

甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]是世界性重要的遷飛害蟲[1]，在亞洲、美洲、歐洲、澳洲及非洲均有發(fā)生和為害的記錄[2]。該種害蟲亦是我國為害玉米、甜菜、花生、棉花、白菜、蘆筍、花菜、蔥、煙草等作物的重要雜食性害蟲[3]。近年來，甜菜夜蛾在各地為害逐年加重，其發(fā)生的范圍有往北擴展的趨勢。

甜菜夜蛾的性信息素的鑒定研究最早始于1972 年[4]，其主要成分為順9 反12-十四碳二烯乙酸酯，但該成分與順9-十四碳烯乙酸酯的組合在田間沒有引誘活性。但加入順9 順12-十四碳二烯乙酸酯和順11-十四碳烯乙酸酯在田間可以誘到雄蛾[5]。真正的突破是1981 鑒定組分為順9 順12-十四碳二烯乙酸酯和順9-十四碳烯醇[6]，日本品系也證明其具有活性[7]，兩者的比例為70∶30 或90∶10。這樣的信息素混合物開發(fā)出的交配干擾技術(shù)在田間大蔥甜菜夜蛾的防控中應用效果良好。卵、1 齡和2 齡的田間蟲口基數(shù)可以下降至6%和1%[8]，以及在溫室中試驗效果也顯著[9]。又鑒定了第3 種組分順11-十六碳烯乙酸酯[10]。在此之后有大量的相關(guān)報道，包括嗅覺感覺及延后交配[11]，以及誘捕[12-13]和交配干擾技術(shù)[14]。我國甜菜夜蛾性信息素組分被鑒定為順9 順12-十四碳二烯乙酸酯和順9-十四碳烯醇9∶1 的混合物，并從實驗室和田間證實了其引誘的有效性[15-16]，一些植物氣味還對性信息素的引誘具有增效作用[17]。甜菜夜蛾的性信息素還存在蟲源地和地理區(qū)系的差異[18]。

目前通常的甜菜夜蛾監(jiān)測采用殺蟲燈及雷達等方法，然而，該蟲是遠距離遷飛性害蟲[19]，其蟲源地、日齡、交配等生理狀態(tài)比較復雜，這些監(jiān)測方法并不能判斷其生理狀態(tài)，遷飛性害蟲的卵巢發(fā)育與其遷飛狀態(tài)有關(guān)[20]。性誘監(jiān)測是一更科學、準確、國際上通用的監(jiān)測方法[21]，并可以指出其誘捕到的靶標害蟲的生理狀態(tài)和蟲源地。但雌蛾性信息素的釋放和卵巢發(fā)育之間的關(guān)系，及其晝夜節(jié)律機制和雄蛾的反應，則還沒有詳細的相關(guān)文獻[22]。為此，本研究開展的甜菜夜蛾的卵巢發(fā)育、性信息素釋放、以及地理區(qū)系和嗅覺反應晝夜節(jié)律之間的關(guān)系，為甜菜夜蛾的性誘測報和防控提供基本方案和數(shù)據(jù)分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

甜菜夜蛾購買于河南省濟源白云實業(yè)有限公司，將蛹按雌雄分開放置在培養(yǎng)箱中，溫度為（25±1）℃，相對濕度為70%±5%，光周期為16L∶8D，17∶00 開始暗期。每日9∶00 收集新羽化出的甜菜夜蛾，放入養(yǎng)蟲籠中，并標記羽化日期。將部分成蟲按雌雄比1∶1 放置在養(yǎng)蟲籠中，待觀察到交配時取出。每日16∶00 飼喂10%的葡萄糖水1次。

1.2 方法

1.2.1 精巢和卵巢解剖及精巢體積測定方法 解剖各日齡未交配的甜菜夜蛾雄蛾，比較不同日齡雄蛾精巢體積及交配后的精巢體積，解剖方法參照文獻。將甜菜夜蛾的腹部取下后，浸泡在75%酒精中去掉表皮，去除脂肪體后使生殖系統(tǒng)暴露出來。將精巢取出后，利用Motic 顯微鏡SMZ-168 和照相系統(tǒng)Moticam 2506(麥克奧迪，廈門)拍照，使用軟件Motic Plus Images 2.0測量雄性精巢的赤道半徑（a，b）及半徑c的長度，根據(jù)橢球體積公式V=4πabc/3計算精巢體積。

取雌蛾將卵巢解剖出來，去除脂肪體后觀察卵巢管的顏色及卵的成熟情況，參照韓蘭芝等[23]方法確定卵巢等級：透明期(I)、卵黃沉積期(II)、成熟待產(chǎn)期(III)、產(chǎn)卵盛期(IV)和產(chǎn)卵末期(V)。

1.2.2 性信息素提取和鑒定、定量方法 每日提取單個未交配雌性甜菜夜蛾性信息素，在暗期6h，取出雌蛾輕輕擠壓腹部，暴露性腺后剪下性腺，用濾紙吸去水分后，放置在色譜瓶中，加入50μL正己烷，浸提1h后，將正己烷吸出，加入10μL十八烷（0.1mg?L-1）作為內(nèi)標。重復6次，氮氣濃縮。取2日齡未交配雌蛾進行性信息素釋放晝夜節(jié)律試驗。

氣質(zhì)聯(lián)用儀采用安捷倫6890GC-5975MS并配有DB-FastFAME毛細管柱(60m×0.25mm×0.25μm)。程序升溫:60℃停留1min，然后每分鐘升溫10℃至180℃，之后每分鐘升溫3℃至210℃，之后每分鐘升溫10℃至250℃維持10 min。離子源溫度為230℃，能壓70eV，載氣為氦氣。通過軟件計算各個性信息素及內(nèi)標的峰面積，根據(jù)性信息素峰面積與內(nèi)標峰面積的比例計算性信息素的相對質(zhì)量。

1.2.3 田間誘蛾晝夜節(jié)律記錄方法 采用寧波紐康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的新型害蟲自動監(jiān)測工具“賽撲星”昆蟲性誘電子智能測報系統(tǒng)（SPT-N-02）監(jiān)測每日、每小時田間誘蛾動態(tài)。性誘智能測報系統(tǒng)每隔1h發(fā)送1次數(shù)據(jù)。賽撲星性誘智能測報系統(tǒng)同時記錄了當日每個小時誘捕器周圍的溫度和濕度。監(jiān)測系統(tǒng)設(shè)置于江蘇省鹽城市大豐市大豐區(qū)綠生源農(nóng)場(120.35°E，33.16°N)和河北省唐山市豐南區(qū)大嶺子村(118.30°E，39.43°N)。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 17.0 軟件進行分析。多組比較采用One-way ANOVA 法，顯著性分析采用LSD 法，兩組平均數(shù)間顯著性差異比較采用Student 氏t 檢驗法。利用Pearson 相關(guān)系數(shù)進行相關(guān)性分析，相關(guān)性分析的顯著性用雙尾t檢驗分析?；貧w分析采用線性回歸法。顯著性分析時p值大于0.05 表示差異不顯著，小于0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜夜蛾卵巢的發(fā)育

將單獨飼養(yǎng)雌性成蟲，每日解剖觀察其卵巢等級。1日齡雌性成蟲卵巢已經(jīng)發(fā)育至卵黃沉積期(II)，3日齡到達成熟待產(chǎn)期(III)，6日齡出現(xiàn)產(chǎn)卵盛期(IV)。至9日齡IV占比達到最高為66.7%。透明期(I)僅在5日齡時發(fā)現(xiàn)1只，產(chǎn)卵末期(V)未發(fā)現(xiàn)（表1）。

表1 不同日齡甜菜夜蛾雌蛾的卵巢發(fā)育Table 1 The ovarian development of the female beet ar‐myworm at different days

2.2 甜菜夜蛾性信息素主要成分的日齡變化

甜菜夜蛾性腺提取物中，主要成分為Z9-14:Ac,Z9E12-14:Ac 和Z11-16:Ac，其相對含量隨日齡增加而降低，9 日齡時相對含量為0。Z9-14:Ac 的含量隨日齡增加變化不明顯，各日齡間無顯著性差異。1 日齡甜菜夜蛾Z9E12-14:Ac 相對含量為（2.30±0.46）ng，7 日齡為（2.72±1.09）ng，顯著高于與其他齡期，9 日齡時相對含量為0。Z11-16:Ac 只在3，4 日齡時檢測到，4 日齡時含量達到最高，相對含量為（1.87±1.01）ng（圖1）。

圖1 不同日齡甜菜夜蛾雌蛾性信息素組成和含量Figure 1 Sex pheromone composition and contents of female Spodoptera exigua at different days

2.3 甜菜夜蛾性信息素主要成分的晝夜節(jié)律

甜菜夜蛾的各個性信息素組分，暗期都能檢測到。Z9-14:Ac、Z9E12-14:Ac 在暗期開始后釋放量逐步增加，在23∶00時達到最高。與之相比較，Z9-14:OH 在暗期開始時也可檢測到，在21∶00時含量最高，而后逐漸減少，1∶00時已檢測不到。Z11-16:Ac 在 23∶00 時出現(xiàn)。只在 23∶00 時出現(xiàn) 4 種主要成分同時存在。值得注意的是，19∶00 時各種成分都沒有檢測到，而17∶00反而檢測到性信息素組分。從相對含量來看，Z9-14:Ac 和Z11-16:Ac含量最高（圖2）。

圖2 甜菜夜蛾雌蛾性信息素主要成分釋放的晝夜節(jié)律Figure 2 The circadian rhythm of the main compo‐nents of sex pheromone released by the female beet armyworm moths

2.4 甜菜夜蛾雄蛾的精巢與日齡的關(guān)系

日齡對甜菜夜蛾雄性精巢體積有顯著性影響（p＜0.001），隨日齡的增加精巢體積呈逐步減少的趨勢，1日齡精巢體積為（2.29±0.30）mm3。2日齡精巢體積為（1.32±0.33）mm3。1 日齡與2 日齡間存在顯著性差異。6 日齡精巢體積為（2.29±0.30）mm3。10 日齡的精巢體積僅為（0.22±0.04）mm3。6 日齡至10 日齡精巢體積無顯著性差異。此外，精巢體積與雄蛾日齡之間存在極顯著線性相關(guān)性(R= -0.836,p＜0.001)，對精巢體積與日齡進行線性回歸分析，得到回歸方程y=-0.185x+1.808 (R2=0.716,p＜0.001)。交配對精巢體積沒有影響（圖3）。

圖3 不同日齡（A）和交配前后（B）的甜菜夜蛾精巢體積變化Figure 3 The testis volume of beet armyworm at different ages (A) and before and after mating (B)

2.5 田間雄蛾對性信息素嗅覺反應的晝夜節(jié)律

圖4 唐山和鹽城2個性誘智能測報系統(tǒng)的誘蛾量晝夜節(jié)律變化Figure 4 Circadian rhythm of hourly moth catches by pheromone trapping in the Smart Monitoring and Reporting Systems by pheromone trapping in Tangshan and Yancheng

對田間實時性誘智能測報系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析可知，甜菜夜蛾雄蛾對性信息素的反應有顯著的晝夜節(jié)律（圖4），但不同季節(jié)和不同地域差異顯著。在河北唐山地區(qū)，7 月底至8 月上旬的一個誘蛾小峰階段，誘蛾時間段在19∶00～5∶00，高峰時間在3∶00～4∶00，而9～10月高峰時間在2∶00～3∶00。7～9月都只有1個誘蛾高峰。9月底至10 月下旬的時段，誘蛾時間段擴大至16∶00～6∶00，其中有2 個峰（18∶00～19∶00 和2∶00～3∶00）。在江蘇鹽城地區(qū)，6 月上旬的1 個誘蛾階段，誘蛾時間段也在19∶00～5∶00，高峰時間在3∶00～4∶00，而9～10 月高峰時間在2∶00～3∶00。7～9月都只有1個誘蛾高峰。9月底至10月下旬的時段，誘蛾時間范圍擴大至17∶00～6∶00，其中有2個峰即18∶00～19∶00和3∶00～4∶00，第1個小高峰并不明顯。相比唐山，鹽城點的誘蛾高峰期時間較短。

2.6 溫濕度與田間雄蛾對性信息素反應的關(guān)系

溫濕度與性信息素的誘捕密切相關(guān)，二個監(jiān)測點的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一的溫度和濕度與誘蛾量之間沒有相關(guān)性，但溫度和濕度的組合與誘蛾量之間有顯著的正相關(guān)（圖5）。

圖5 誘蛾量與溫濕度之間的相關(guān)性（A.唐山；B. 鹽城）Figure 5 Correlation between moth catches by pheromone trapping and temperature as well as humidity(A. Tangshan; B. Yancheng)

3 討論與結(jié)論

昆蟲的求偶行為涉及雌蛾性信息素的釋放和雄蛾的嗅覺反應。雌蛾的性信息素生物生物合成和釋放受諸多因素的影響。其中，日齡顯著影響雌蛾發(fā)育，特別是卵巢發(fā)育，性信息素釋放只有在性成熟、可以交配時釋放[24]。雄蛾通過影響昆蟲嗅覺基因表達，從而影響嗅覺反應譜[25]，最終影響昆蟲的發(fā)情與交配行為。甜菜夜蛾成蛾在羽化后即可交配[2]，雌蛾在羽化后1 日齡就有較高的性信息素釋放，而且卵巢分級達到Ⅱ級。交配對甜菜夜蛾雌蛾性信息素各組分的滴度、比例及其在個體間的變異均無顯著的影響,因此交配不影響雌蛾在下一暗期的再次求偶和交配。本研究結(jié)果表明交配對雄蛾的精巢體積也沒有影響。

甜菜夜蛾的性信息素釋放也具有晝夜節(jié)律變化。雄蛾對性信息素的反應也有晝夜節(jié)律，成蟲一天中的交配時間出現(xiàn)于23∶30 ～05∶30，交配高峰出現(xiàn)在01∶30～02∶30 和03∶00～04∶00[2]，而性信息素的釋放則早于交配時間，可以推測性信息素的釋放時間與求偶行為時間比較一致。順9 順12-十四碳二烯乙酸酯和順9-十四碳烯醇被認為是我國甜菜夜蛾性信息素成分[26]，順9 順12-十四碳二烯乙酸酯和順9-十四碳烯醇的釋放時間很短，而且高峰期在時間上也不一致。從相對含量來看，Z9-14:Ac 和Z11-16:Ac 反而最高，這2 個組分在之前的報道中并沒有被鑒定出是我國甜菜夜蛾的性信息素組分之一[15]，其釋放時間與主成分也不同步，這可能是各種報道沒有完整鑒定全組分的一個原因。從實驗室的數(shù)據(jù)來比較，日齡與求偶的起始時間和晝夜節(jié)律有關(guān)系[26]。結(jié)合田間監(jiān)測的甜菜夜蛾性信息素誘捕晝夜節(jié)律數(shù)據(jù)，從雌雄兩者釋放和接收的時間段來比較，雄蛾接受性信息素氣味分子的嗅覺反應時間范圍相對比較寬。人工合成的性信息素是通過緩釋材料誘芯釋放氣味分子在田間擴散，因此，在田間誘芯是24h整天、不間斷釋放，并借助于氣流的擴散、傳播，而田間自然雌蛾只有在晚上某一特定時間段釋放性信息素求偶，在時間和范圍上都有一定的局限性，因此，誘捕器在誘捕甜菜夜蛾雄蛾的時間段上具有競爭上的優(yōu)勢。這也是性誘測報和防控效率高的原因之一。

環(huán)境溫度不僅影響自然雌蛾性信息素的生物合成和釋放[27]，還對誘捕器中誘芯的合成性信息素化合物的穩(wěn)定性和釋放速率產(chǎn)生影響，也就是與誘芯在田間的持效期密切相關(guān)，同時，也影響雄蛾的交配、飛行活性。每一種昆蟲都有其特定的適宜生存和活動的溫度范圍，在適宜溫度環(huán)境下，昆蟲比較活躍，飛行范圍大，對性信息素的反應也比較敏感。已有報道表明，15～25℃最有利于甜菜夜蛾性信息素的產(chǎn)生，而10℃低溫和35 ℃高溫則使性信息素產(chǎn)生受到明顯影響，其中以10℃低溫的影響更甚。10 ℃低溫處理不僅使各組分的滴度產(chǎn)生顯著改變，而且使二元性信息素組分的比例受到顯著影響。水與羽化后的蛾子關(guān)系密切，鱗翅目成蟲不一定需要補充營養(yǎng)，但需要水[28]，可以理解濕度在蛾子活動中的重要性。本研究中田間環(huán)境溫度與性誘蛾量相關(guān)性并不顯著，但與溫度和濕度的組合關(guān)系顯著，說明在一定適宜溫度范圍內(nèi)，高溫及高濕下的誘蛾量增加。

在傳統(tǒng)測報中，對于稻縱卷葉螟、粘蟲、甜菜夜蛾等遷飛性害蟲的監(jiān)測，需要通過解剖卵巢，觀察卵巢的發(fā)育狀態(tài)和分級，進而推斷其遷飛性和可能的危害，這樣的測報方法工作量大，既不方便，又需要專業(yè)人士才能具體操作。通過開展燈誘和性誘測報方法，可以大大降低工作強度，提高測報準確性，而燈誘與性誘之間不是一個簡單的線性關(guān)系，一般越冬代燈誘效果較差，無法通過燈誘監(jiān)測到蛾峰，燈誘的雄蛾和雌蛾生理狀態(tài)區(qū)分也比較困難，開展性誘監(jiān)測，可以有效解決這樣的問題。本試驗證實了甜菜夜蛾卵巢發(fā)育與性信息素合成和釋放比較吻合，通過甜菜夜蛾生理狀態(tài)和環(huán)境因子分析了雌蛾卵巢發(fā)育、性信息素釋放與雄蛾誘捕之間的關(guān)系，為性誘預測預報甜菜夜蛾的發(fā)生提供了理論基礎(chǔ)。