利用SSR標(biāo)記構(gòu)建部分山楂資源的基因身份證

張 梟，杜 瀟，孫馨宇，王 鍵，董文軒

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽110161；2.通化市園藝研究所，吉林通化134001）

山楂屬植物（CrataegusL.）為薔薇科中一個(gè)較古老的屬，廣泛分布于北半球溫帶。20 世紀(jì)中期，山楂屬植物的分組相關(guān)研究中，將山楂屬植物分為25個(gè)組[1]。我國原產(chǎn)的山楂屬植物通常認(rèn)為是6個(gè)組，包括18個(gè)種和6個(gè)變種[2]，經(jīng)過長期的選擇，形成了豐富的種質(zhì)資源。傳統(tǒng)山楂屬植物的種類劃分基于形態(tài)特征和地理分布，廣泛存在于山楂屬植物中的無融合生殖、種間雜交以及多倍化等現(xiàn)象導(dǎo)致其形態(tài)學(xué)特征發(fā)生高度遺傳變異[2]，同時(shí)也造成山楂資源中普遍存在的同物異名和同名異物現(xiàn)象，給山楂屬植物的種類劃分及資源鑒定帶來了較大困難。開展山楂種質(zhì)資源的特異性識(shí)別技術(shù)探索，準(zhǔn)確鑒定山楂資源的特異性，可為資源的保存與合理利用提供理論基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)等資源鑒定方法易受環(huán)境條件、生長狀態(tài)、發(fā)育時(shí)期等因素的影響，且需要鑒定者具備較為專業(yè)素養(yǎng)，耗時(shí)費(fèi)力。利用分子標(biāo)記鑒定資源，則可避免以上因素，且操作簡便、快速、穩(wěn)定[3]。SSR 標(biāo)記作為共顯性分子標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]。近年來，已廣泛應(yīng)用于葡萄[5]、澳洲堅(jiān)果[6]等果樹種間雜種的鑒定；柑橘[7]、棗樹[8]等多倍體果樹資源的發(fā)掘與鑒定。國際植物品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）于2007 年已將SSR 標(biāo)記確定為植物新品種保護(hù)最廣泛應(yīng)用的分子標(biāo)記體系之一[9]。分子身份證在SSR 指紋圖譜的基礎(chǔ)上，基于一定原則對(duì)SSR 指紋進(jìn)行字符編碼，獲得可快速、準(zhǔn)確區(qū)分不同種質(zhì)資源的字符串。基于SSR 標(biāo)記的分子身份證研究在山茶[10]、苦蕎[11]、蘿卜[12]、百合[13]、水稻[14]、及果樹種質(zhì)資源包括桃[15]、蘋果[16]、葡萄[17]和梨[18]上已有相關(guān)報(bào)道。SSR 標(biāo)記在山楂屬植物的種類劃分中已有研究[19-20]。與RAPD和ISSR 相比，SSR 標(biāo)記在山楂基因型遺傳變異與種間關(guān)系的研究中更具優(yōu)勢[21]。XU 等[22]利用二代測序技術(shù)對(duì)山楂進(jìn)行高通量測序，獲得了大量的SSR 信息。DU 等[23]選取山楂轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)中200 對(duì)SSR 引物，篩選得到40 對(duì)具有多態(tài)性的SSR 引物，用于探索我國原產(chǎn)7 個(gè)山楂種的種間關(guān)系。勞永春[24]利用12 對(duì)多態(tài)性好的SSR引物鑒定了39 份山楂存疑資源。上述研究均表明SSR 標(biāo)記可有效用于山楂資源鑒定及遺傳多樣性分析。目前山楂種質(zhì)資源尚未制定資源鑒定標(biāo)準(zhǔn)。本研究利用SSR 標(biāo)記對(duì)國家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃內(nèi)48 份山楂種質(zhì)資源進(jìn)行分子條形碼開發(fā)，旨在為資源圃內(nèi)山楂屬植物的鑒定和保護(hù)，及國內(nèi)外山楂種質(zhì)資源收集、保存與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2018 年4 月下旬在國家果樹種質(zhì)沈陽山楂圃內(nèi)采集48 份山楂屬資源。其中10 份伏山楂（C.Brettschneideri）資源包括來自吉林省的吉伏1號(hào)、吉伏2號(hào)、左伏1號(hào)、左伏2號(hào)、財(cái)紅、555和82015；遼寧省的沈農(nóng)伏山楂1號(hào)、伏里紅和遼寧大果。4份毛山楂（C.Maximowiczii）資源包括來自黑龍江省的毛山楂1號(hào)、毛山楂2號(hào)、毛山楂3號(hào)和蘇4。4份來自遼寧省的遼寧山楂（C.Sanguinea）1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)和4號(hào)。9份羽裂山楂（C.Pinnatifida）資源包括來自內(nèi)蒙古自治區(qū)的野生山里紅1號(hào)、山西省的野生山里紅2號(hào)、山東省的野生山里紅3號(hào)和野生山里紅4 號(hào)、黑龍江省的野生山里紅6 號(hào)及遼寧省的野生山里紅5 號(hào)、野生山里紅7 號(hào)、野生山里紅8 號(hào)和野生山里紅9 號(hào)。12 份羽裂山楂大果變種（C.Pinnatifidavar.）資源包括來自遼寧省的清原磨盤、開原軟籽、遼紅、黃果山楂和秋金星；山東省的費(fèi)縣大棉球、蒙陰大金星、白瓤綿和益都敞口；河北省的霧靈紫肉；北京市的京短1號(hào)；吉林省的大旺山楂。6份湖北山楂（C.Hupehesis）包括來自湖北省的湖北山楂1號(hào)、湖北山楂2號(hào)和湖北山楂3 號(hào)；山東省的泰安實(shí)生、憲平砧木和牧狐梨。2 份來自云南省的云南山楂（C.Scabrifolia）1 號(hào)和2 號(hào)。每份資源采集3棵山楂樹的新鮮、幼嫩葉芽，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 試材DNA的提取 參考李媛媛[25]的方法，選取山楂幼嫩葉片采用改良的CTAB 法提取總DNA。改良的步驟包括將預(yù)熱的CTAB 提取緩沖液加入0.2%巰基乙醇；加入500μL 的氯仿/異戊醇（24∶1）抽提2 次，加入480μL 預(yù)冷的無水乙醇混勻-20℃靜置30min；使用RNase（10μg·μL-1）混勻水浴后，加入3mol·L-1NaAc（pH =5.2）；100μL DNA，-20℃保存于1∶10 的TE 溶液中。用瓊脂糖電泳檢測DNA 條帶（瓊脂糖濃度1%，點(diǎn)樣體積2μL，電泳電壓100 V，應(yīng)用1×TBE 電泳緩沖液），NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度（取DNA 10μL 稀釋100 倍，點(diǎn)樣體積1μL，測定DNA樣品的分光光度值D260nm和D280nm，并計(jì)算D260nm/D280nm比值和DNA濃度。將每份樣品DNA稀釋至20～30ng·L-1，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)與聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR 擴(kuò)增選用DU 等[23]研究中多態(tài)性好的14 對(duì)SSR 引物，引物信息見表1。PCR 反應(yīng)體系20μL，包含1μL DNA 模板，7μL 2× Es MasterMix buffer，2μL 正反向引物，10μL超純?nèi)ルx子水。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，56～59℃退火1min，72℃延伸1min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。Thermal Cycler（Applied Biosystems，美國）中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物點(diǎn)入含6%聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE buffer中進(jìn)行電泳檢測，電泳后銀染法顯色，燈箱下觀察，記錄SSR擴(kuò)增條帶。

表1 本試驗(yàn)中所用SSR引物Table 1 SSR primers used in this study

1.2.3 遺傳多樣性及聚類分析 將所得電泳圖進(jìn)行讀帶，根據(jù)擴(kuò)增片段大小依次讀取，有帶記“1”，無帶記“0”，形成“0-1”矩陣。使用Popgene 32 計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon 信息指數(shù)（Shannon’s information index，I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、遺傳分化系數(shù)（Fst）；Cervus 計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。使用NTsys 2.10e 計(jì)算相似系數(shù)，利用SAHN 模塊的非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Means，UPGMA）繪制48份山楂資源的聚類分析樹狀圖。

1.2.4 數(shù)據(jù)的處理和二維碼的轉(zhuǎn)換 獲得原始數(shù)據(jù)的第1 位點(diǎn)、第2 位點(diǎn)、第3 位點(diǎn)、第4 位點(diǎn)參考劉冠群等[10]文中編碼原則進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，獲得每個(gè)引物擴(kuò)增條帶的相應(yīng)編碼數(shù)字。根據(jù)本試驗(yàn)中引物順序，將所有引物對(duì)應(yīng)的編碼數(shù)字及字母串聯(lián)成字符串，于在線條碼生成器（http://barcode.cnaidc.com/html/BCGcode128b.php）生成條形碼及二維碼圖像，所得條形碼為該資源的條形碼DNA分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂資源SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

以山楂屬中48份資源的DNA模板為擴(kuò)增對(duì)象，利用14對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，獲得各引物多態(tài)性條帶。每對(duì)引物擴(kuò)增出等位基因數(shù)2～4 個(gè)。有效等位基因數(shù)（Ne）變幅為1.176（C60）至1.969（C40），均值1.680；Shannon’s 多樣性指數(shù) I 變幅為0.283（C60）至0.686（C66），均值0.582；多態(tài)信息含量（PIC）變幅 0.139（C60）至0.372（C66），均值0.311（表2）。本試驗(yàn)中，遺傳分化系數(shù)Fst 范圍從0.057（C4）至0.742（C66），均值0.447，說明48份山楂資源種間存在較大的遺傳分化。

2.2 基于SSR標(biāo)記的聚類分析

14對(duì)SSR引物獲得等位基因頻率計(jì)算資源間的相似系數(shù)為0.290～0.968。48份山楂資源中。山東的益都敞口與遼寧的清原磨盤及北京的京短1 號(hào)相似系數(shù)最大（0.968）；遼寧的遼紅與黑龍江的毛山楂2 號(hào)的相似系數(shù)最小（0.290）。

聚類分析結(jié)果（圖1）表明，14對(duì)SSR引物可將48份資源區(qū)分為2組，其中屬于伏山楂、羽裂山楂、羽裂山楂大果變種、湖北山楂和云南山楂的資源為組Ⅰ。來自遼寧、山東、河北和吉林羽裂山楂大果變種資源與湖北山楂1 號(hào)、2 號(hào)聚為其中一分支；來自內(nèi)蒙古的野生山里紅1 號(hào)、山西的野生山里紅2 號(hào)、黑龍江的野生山里紅6號(hào)、遼寧的野生山里紅9號(hào)與云南山楂的1號(hào)、2號(hào)聚為其中一分支；遼寧與吉林的伏山楂資源與山東的野生山里紅3 號(hào)和牧狐梨及遼寧的野生山里紅5 號(hào)、7 號(hào)聚為其中一分支。毛山楂和遼寧山楂資源分為組Ⅱ：毛山楂1～3號(hào)、寧安山楂、蘇4與遼寧山楂1～3號(hào)聚為一支，親緣關(guān)系較近，且與其他種山楂資源親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

利用Popgene 32 軟件基于Nei's 遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類分析山楂屬資源種屬差異（圖2）。7 個(gè)山楂種之間，羽裂山楂與伏山楂親緣關(guān)系最近，距離為2.388；湖北山楂與羽裂山楂大果變種的距離較近，為2.406；云南山楂與伏山楂及羽裂山楂距離較近（“4”到“1”的距離為4.468）。毛山楂與遼寧山楂的親緣關(guān)系最近，為2.406，這兩個(gè)種與其他種山楂親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（“6”到“5”的距離為17.641；“6”到“3”的距離為20.703）。

表2 14對(duì)SSR引物在48份山楂資源中多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification information of 14 pairs of SSR primers in 48 Crataegus resources

圖1 48份山楂資源UPGMA聚類分析樹狀圖Figure 1 Dendrogram of 48 Crataegus resources using UPGMA cluster analysis

2.3 山楂資源分子身份證的構(gòu)建

分子身份證代碼構(gòu)建的方法參考劉冠群等[10]的方法。14 對(duì)SSR 引物擴(kuò)增48 份山楂資源的電泳條帶結(jié)果進(jìn)行人工讀帶，將同一引物擴(kuò)增出的條帶按大小依次排序統(tǒng)計(jì)。根據(jù)位點(diǎn)的等位基因的差異，標(biāo)記為A/A、B/B、C/C、D/D 等基因型，根據(jù)表3的原則進(jìn)行編碼，并按14對(duì)引物順序建立數(shù)據(jù)矩陣。表2分析結(jié)果中等位基因數(shù)為2或4，因此編碼范圍為1～9及A、B。其中無等位基因編碼為“B”，即表3中“其他”。。當(dāng)SSR引物擴(kuò)增出2個(gè)等位基因，條帶數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為“1，0”時(shí)記為“A/A”；“0，1”時(shí)記為“B/B”；“1，1”時(shí)記為“A、B”，存在4種類型；當(dāng)SR引物擴(kuò)增出4個(gè)等位基因，存在11種類型（表3）。

圖2 山楂資源不同種群分析樹狀圖Figure 2 Dendrogram of Crataegus population based Nei's genetic distance using UPGMA method

14 對(duì)引物形成的分子身份證共14 位數(shù)字及字母，每份資源僅有唯一的分子身份證號(hào)。將對(duì)應(yīng)的數(shù)字串編碼輸入在線條碼生成器，選取Code-128模式生成供掃描的分子身份證條形碼。編碼結(jié)果及分子身份證條形碼詳見表4。

表3 不同基因型的編號(hào)Table 3 Code of different genotypes

3 討論與結(jié)論

分子身份證可給與種質(zhì)資源唯一的標(biāo)識(shí)，用于區(qū)分品種，操作快速便捷[15]。建立分子身份證，將DNA 指紋圖片進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換，更便于種質(zhì)資源的檢索及識(shí)別[26]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布了關(guān)于植物品種鑒定DNA 分子標(biāo)記法（NY/T 2594-2016）、玉米品種鑒定SSR 標(biāo)記法（NY/T 1432-2014）、水稻品種鑒定SSR 標(biāo)記法（NY/T 1433-2014），蘋果品種鑒定規(guī)程SSR分子標(biāo)記發(fā)（NY/T 2478-2013），柑橘屬品種鑒定SSR分子標(biāo)記法（NY/T 3436-2019），棗品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR 分子標(biāo)記法（NY/T 2426-2015），江蘇省梨品種DNA 指紋圖譜鑒別規(guī)范（DB32/T 2089-2012）和河北省葡萄品種DNA 指紋鑒定方法（DB13/T 1567-2012）等標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)可為SSR法鑒定山楂種質(zhì)資源提供有效參考。

構(gòu)建分子身份證的編碼方式主要包含以下類型：將每對(duì)引物擴(kuò)增的條帶按從小到大排列，依次編碼，有兩個(gè)等位基因時(shí)取其中堿基數(shù)較少的一個(gè)[15]；將SSR圖譜結(jié)果的“0-1”字符串由二進(jìn)制轉(zhuǎn)化為十進(jìn)制編碼[27]；將獲得一系列帶型用數(shù)字進(jìn)行編碼，按照固定引物順序，串聯(lián)各帶型編碼，形成一組數(shù)據(jù)，即該品種的分子身份證[28]。本研究中利用14對(duì)已驗(yàn)證過多態(tài)性的SSR 標(biāo)記[23]，為每一個(gè)位點(diǎn)的帶型數(shù)據(jù)進(jìn)行編碼。14對(duì)引物在48份山楂資源中，每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為2～4 個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）變幅1.176～1.969，均值1.680；多態(tài)信息含量（PIC）變幅0.139～0.372，均值0.311。編碼時(shí)，采用1～9 及A、B 共11 個(gè)字符對(duì)等位基因進(jìn)行編碼，每一對(duì)引物在分子身份證上對(duì)應(yīng)一位字符，串聯(lián)構(gòu)成山楂資源的DNA條形碼。

山楂資源植物學(xué)特征的鑒定評(píng)價(jià)受外界環(huán)境影響比較大。描述山楂資源的鑒定評(píng)價(jià)與新品種特異性、一致性、穩(wěn)定性基于《山楂資源的鑒定農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范山楂（NY/T 2325-2013）》和DUS 測試。DUS 測試要求更加嚴(yán)格，所選測試材料為1～3 年無性繁殖的植株，且至少在測試地點(diǎn)定植2 年以上，測試周期為1～2個(gè)生長周期。目前將分子身份證引入DUS測試，完善測試內(nèi)容，提高測試效率已成為新發(fā)展趨勢[29]。本研究構(gòu)建了48 份山楂資源的分子身份證，并將其生成分子條形碼，條形碼的數(shù)字串可以被具有掃碼功能機(jī)器解讀，快速地識(shí)別不同山楂資源身份信息。同時(shí)，構(gòu)建山楂種質(zhì)資源分子身份證數(shù)據(jù)信息庫，為每份資源設(shè)立獨(dú)立分子身份證，可提高山楂資源鑒定、評(píng)價(jià)與利用效率。

隨著山楂資源的不斷收集和鑒定，可能產(chǎn)生本研究中不包含的帶型。根據(jù)劉峰等[30]可鑒別區(qū)分的最大品種數(shù)的計(jì)算公式為N=G1×…×Gn，理論上所選用的14 對(duì)引物最多可以區(qū)分214 份山楂資源，基本可以滿足種質(zhì)

資源鑒定的需求。但14對(duì)引物有可能無法區(qū)分部分資源。因此在今后山楂資源分子身份證庫的建立過程中，可增加多態(tài)信息含量高、區(qū)分資源能力強(qiáng)的SSR標(biāo)記，或結(jié)合其他類型的分子標(biāo)記進(jìn)行資源鑒定。

表4 48份山楂資源的條形碼DNA分子身份證Table 4 DNA molecular identify cards of 48 Crataegus resources

本研究利用14 對(duì)SSR 分子標(biāo)記，區(qū)分來源于不同省份的48 份山楂種質(zhì)資源，并在建立SSR 指紋圖譜基礎(chǔ)上編碼獲得分子身份號(hào)，形成每份山楂資源的可供快速識(shí)別的條形碼即分子身份證，為鑒定和保護(hù)山楂種質(zhì)資源收集、保存與利用提供理論依據(jù)。