東北地區(qū)秋子梨果實糖酸、酚類成分及其生物活性分析

曹曉云 ，劉永富 ，石娟華，劉 暢，王 強，張茂君，汪曉謙，杜國棟

（1.沈陽農業(yè)大學園藝學院，沈陽 110161；2.河北省邯鄲市永年區(qū)自然資源和規(guī)劃局，河北邯鄲057150；3.吉林省農業(yè)科學院果樹研究所，吉林公主嶺136100）

梨是世界上最重要的果樹之一，其果實因良好的風味和較高的營養(yǎng)價值而備受人們青睞。果實中糖酸的組成和含量直接影響梨果風味，主要反映梨果口感[1-2]。酚類物質對梨果顏色及營養(yǎng)保健功效的形成有重要作用[3-4]，如黃酮類物質有多種藥理活性，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等多種功效[5-6]。在我國，梨的栽培已有3000 多年的歷史，種質資源十分豐富[7]，不同地域不同品種間營養(yǎng)物質含量差異較大。秋子梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）是我國東北地區(qū)主要的梨栽培種類[8]，包括南果梨、京白梨、花蓋梨等優(yōu)良品種，在寒地果樹生產中有十分重要的地位。關于梨果實的化學成分和抗氧化能力已有報道，但主要針對砂梨和西洋梨進行研究，對秋子梨的品質、酚類成分及生物活性研究甚少[9-10]。本研究對6個常見秋子梨品種果實的糖酸、酚類成分進行分析比較，并對其抗氧化、抗炎及抑菌效果進行詳細研究，研究結果對于秋子梨品種資源的進一步利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試6個秋子梨栽培品種（尖把梨、南果梨、京白梨、安梨、大香水和紅花蓋）的果實材料取自國家果樹種質公主嶺寒地果樹資源圃。根據果實切面淀粉染色的程度確定最佳采收期[11]，在染色程度達到40%之前采收。試驗設3次重復，每個重復取10個大小一致的果實，去除果核，將果皮和果肉分離并置于-80°C冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 糖和有機酸的提取和分析 分別稱取果皮或果肉樣品0.2g，加入2mL去離子水進行糖和有機酸的提取，離心后取上清液，重復提取2次，過0.22μm水系濾膜，之后在配有二極管陣列檢測器和自動進樣器的Agilent1200液相色譜儀上進行檢測，重復3次。糖的分離使用Carbomix Ca-NP色譜柱（300mm×7.8 mm，10μm；美國賽分科技），流動相為去離子水，流速0.6mL·min-1。有機酸的分離使用ZORBAX SB-Aq色譜柱（250×4.6mm，5μm；美國安捷倫），流動相為20mmol·L-1NaH2PO4（pH 值2.6），流速0.7mL·min-1。

1.2.2 果實提取液的制備 參照WANG等的方法制備提取液[12]。2.0g樣品加入20mL提取液（70%甲醇），振蕩（1500r·min-1，15℃，1h）提取，離心收集上清液，重復提取2次后，使用真空濃縮儀進行濃縮（45℃，5.5h），用蒸餾水溶解，于4°C保存，用于酚類物質及生物活性分析。

1.2.3 酚類物質的分析 使用液相質譜聯(lián)用儀UPLC-MS（Waters）分析果實提取液的酚類物質含量，進樣量為10μL。使用Waters Acquity BEH C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.7mm）進行梯度分離，流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和純乙腈（B）組成。在梯度洗脫過程中，流速為0.35mL·min-1，流動相比例為2%B（0min），30%B（10min）和95%B（12min）。質譜毛細管電壓為2.5kV，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為500℃，脫溶劑氣流量為1000L·h-1。

1.2.4 抗氧化能力分析 抗氧化活性采用DPPH自由基清除能力和鐵離子還原能力（FRAP）表示，DPPH清除能力測定參考BRAND-WILLIAMS等[13]的方法，F(xiàn)RAP測定參考BENZIE等[14]的方法。使用Trolox作為對照，結果用Trolox當量（TE）的抗氧化能力表示（μmol TE·g-1FW）。

1.2.5 抗炎活性分析 抗炎活性的測定參考SARAVANAN等[15]的方法，略有改動。使用雙氯芬酸鈉作為標準藥物，蒸餾水作為空白對照。將2mL提取液（濃度250μg·mL-1）或標準藥物（濃度250μg·mL-1）、2.8mL磷酸緩沖溶液（pH值6.4）、25μL雞蛋清蛋白進行混合，37℃培養(yǎng)15min。之后在70℃水浴中反應10min，冷卻后使用分光光度計在660nm處測定吸光值，試驗設3次重復?？寡茁实挠嬎愎綖椋嚎寡茁剩?）=[（At-Ac）/Ac]×100（At是實驗組的吸光度；Ac是對照組的吸光度）。

1.2.6 抑菌效果分析 抑菌效果分析參照李曉東的方法[16]。首先制備牛肉膏蛋白胨固體和液體培養(yǎng)基，使用移液槍吸取300μL大腸桿菌（革蘭氏陰性細菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性細菌）的菌懸液（菌液濃度為106CFU?mL-1）分別加入培養(yǎng)基，進行平板涂布，靜置待表面干燥后使用。將專用的6mm藥敏紙片浸入果實提取液1h，之后貼放于平板表面，做好記號，以無菌水浸濕的紙片為陰性對照。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，測量抑菌圈的直徑，重復3次。

1.3 數據處理方法

試驗所得數據結果采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析，圖及主成分分析（PCA）使用Origin 2019b軟件完成。

2 結果與分析

2.1 不同秋子梨的糖和有機酸含量

由圖1 可知，糖和有機酸的含量因品種和組織部位的不同而差異顯著。果皮中的總糖含量為54.02～76.23 mg·g-1，其中南果梨的總糖含量最高，安梨的總糖含量最低。果肉中的總糖含量為73.06～98.22mg·g-1，其中尖把梨的總糖含量最高，大香水的總糖含量最低。在所有梨果實中均檢測到果糖、蔗糖、山梨糖醇和葡萄糖。果皮中南果梨的果糖和葡萄糖含量最高，分別為32.59mg·g-1和18.20mg·g-1，尖把梨的蔗糖含量最高，為29.74mg·g-1。果肉中南果梨的果糖含量最高，為49.41 mg·g-1，尖把梨的蔗糖含量最高，為41.34mg·g-1。

圖1 不同秋子梨果皮和果肉的糖和有機酸含量Figure 1 Sugar and organic acid composition in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

秋子梨中主要的有機酸類型是蘋果酸和檸檬酸，其次是奎尼酸，另外含有少量的乳酸和莽草酸。果皮中有機酸的含量為9.94～37.46mg·g-1，其中京白梨的有機酸含量最高，紅花蓋的有機酸含量最低。果肉中有機酸含量為13.31～66.59mg·g-1，其中尖把梨的有機酸含量最高，京白梨的有機酸含量最低。在所有梨果實中均檢測到5 種有機酸，其中蘋果酸和檸檬酸是主要的有機酸。果皮中京白梨的蘋果酸含量最高，為30.54mg·g-1，其次是尖把梨，為23.52mg·g-1，大香水的檸檬酸含量高，為6.65mg·g-1。果肉中尖把梨的蘋果酸含量最高，為46.70mg·g-1，而京白梨的蘋果酸含量最低，為9.12mg·g-1，紅花蓋的檸檬酸含量最高，為25.81mg·g-1。

2.2 不同秋子梨的酚類物質含量

圖2 不同秋子梨果皮和果肉的酚類物質含量Figure 2 Phenolic composition in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

通過UPLC-MS分析，共鑒定到16種酚類物質，包括羥基肉桂酸、對苯二酚、黃烷醇、黃酮醇和花青素（僅在果皮中）。本研究共檢測到3種羥基肉桂酸（綠原酸，咖啡酸和對香豆酸），其中綠原酸是主要的種類，果皮中的綠原酸含量最豐富，為100.94～212.97mg·kg-1，果肉中綠原酸的含量為21.16～125.26mg·kg-1（圖2）。對苯二酚化合物熊果苷在梨中含量較高。果皮熊果苷的含量為42.58～489.64mg·kg-1，果肉熊果苷含量為4.92～17.26mg·kg-1，其中京白梨的果皮熊果苷含量最高，而尖把梨的果肉熊果苷含量最高。

本研究共檢測到4 種黃烷醇，包括2 種單體（兒茶素和表兒茶素）和2 種二聚體（原花青素B1 和B2）。果皮中的黃烷醇含量為67.57～460.48mg·kg-1，果肉中黃烷醇含量為1.18～35.17mg·kg-1。在果皮和果肉中，尖把梨的黃烷醇含量均為最高，而京白梨的含量最低。黃酮醇是另一種重要的類黃酮化合物，UPLC-MS 分析檢測到7種黃酮醇，包括4種槲皮素和3種異鼠李素糖苷。果皮中黃酮醇的含量為92.20～677.87mg·kg-1，果肉中為0.84～4.22mg·kg-1。其中，安梨的果皮黃酮醇含量最高，而尖把梨的果肉黃酮醇含量最高。矢車菊素-3-半乳糖苷屬花青素類物質，只在紅花蓋和南果梨的果皮中檢測到?？偡雍涂傸S酮含量可用來評價梨果實的營養(yǎng)價值，本研究中，總黃酮含量的變化趨勢與總酚含量相似。果皮的總酚含量為354.18～1190.14mg·kg-1，果肉的總酚含量為28.27～182.11mg·kg-1。綜合來看，不同品種秋子梨的酚類含量差異較大。果皮中所含的酚類物質含量明顯高于果肉，其中尖把梨果肉的總酚含量最高。在果皮和果肉中，尖把梨的黃烷醇和槲皮素衍生物的含量最高，安梨的異鼠李素衍生物的含量最高。

2.3 不同秋子梨的抗氧化活性

由圖 3 可知，在果皮中，DPPH 清除能力和鐵離子還原能力（FRAP）分別為 13.46～36.87μmol TE·g-1和17.80～39.29μmol TE·g-1。在果肉中分別為3.08～8.71μmol TE·g-1和3.79～14.12μmol TE·g-1。京白梨的果皮提取物的抗氧化能力均為最高，大香水則為最低。

圖3 不同秋子梨果皮和果肉的抗氧化活性Figure 3 Antioxidant activities in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

2.4 不同秋子梨的抗炎活性

由圖4 可知，京白梨的果皮提取物抗炎效果最好（抑制率為52.65%），安梨的果皮提取物抗炎效果最差（抑制率為45.37%）。紅花蓋的果皮提取物抗炎效果最好（抑制率為51.57%），南果梨的果皮提取物抗炎效果最差（抑制率為45.69%）。標準抗炎藥物雙氯芬酸鈉抗炎活性最大，抑制可達52.94%。可見，6 種秋子梨的果皮提取物和果肉提取物均表現(xiàn)出良好的抗炎效果，與標準藥物活性接近。

2.5 不同秋子梨的抑菌活性

由表1 可知，供試品種中，果皮與果肉的提取物均顯示出有效的抑菌效果，但果皮提取物的抑菌效果更好。另外，果實提取物對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，而對大腸桿菌的抑菌效果稍差。對不同品種進行比較發(fā)現(xiàn)，尖把梨和紅花蓋的提取物具有較強的抑菌效果。

圖4 不同秋子梨果皮和果肉的體外抗炎活性Figure 4 In vitro anti-inflammatory activity in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

表1 不同秋子梨果皮和果肉的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

2.6 不同秋子梨的品質指標的主成分分析

對6個品種秋子梨的9個品質指標進行主成分分析（表2），在果皮中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的方差貢獻率累積達到72.57%，其中PC1的方差貢獻率達到46.92%，抗氧化活性、總酚、總黃酮、總糖和抑菌效果與PC1有較強的正相關性，而有機酸、體外抗炎活性和抑菌效果與PC2有較強的正相關性。在果肉中，PC1和PC2的方差貢獻率累積達到84.77%，其中PC1 的方差貢獻達到60.71%，糖酸、抗氧化活性、總酚和總黃酮與PC1 有較強的正相關性，體外抗炎活性和抑菌效果與PC2有較強的正相關性。

表2 不同秋子梨品質指標主成分載荷矩陣Table 2 Principal component loading matrix of quality index of different Pyrus ussuriensis cultivars

表3 表示降維后不同品種在PC1 和PC2 上的得分值。在果皮中，PC1 表示不同品種秋子梨的抗氧化活性、總酚、總黃酮、總糖和抑菌效果的得分情況，不同品種的得分差異較大，其中尖把梨、南果梨和京白梨的得分高于其他秋子梨品種；PC2表示有機酸、體外抗炎活性和抑菌效果的得分情況，尖把梨、京白梨和大香水的得分高于其他秋子梨品種。在果肉中，PC1表示不同品種秋子梨的糖酸、抗氧化活性、總酚和總黃酮含量的得分情況，尖把梨的得分高于其他秋子梨品種；PC2表示不同品種秋子梨的體外抗炎活性和抑菌效果的得分情況，紅花蓋的得分高于其他秋子梨品種。

表3 不同秋子梨果實品質指標主成分得分Table 3 Component scores of quality index of different Pyrus ussuriensis cultivars

3 討論與結論

糖酸含量對水果風味有至關重要的影響，糖在梨果實甜度中起關鍵作用。本研究中共檢測到4 種糖（果糖、蔗糖、葡萄糖和山梨糖醇），多數品種中，主要的糖是果糖，而在紅花蓋中，主要的糖是蔗糖。這些結果與ZHANG 等[17]的發(fā)現(xiàn)是一致的，他們的研究表明，蔗糖含量在梨的成熟果實中表現(xiàn)出很大的差異性。本研究的秋子梨品種中共檢測到5 種有機酸，其中蘋果酸和檸檬酸是主要的有機酸，這與KOLNIAK-OSTEK[18]的研究結果一致。其中，尖把梨不僅蘋果酸含量最高，有機酸總量也是最高的。綜合分析，秋子梨不同品種和部位間的糖和有機酸含量差異較大。

酚類物質作為植物的次生代謝產物，對秋子梨的顏色、風味和品質等特性產生重要影響。本研究檢測到的多酚化合物可分為5 類：羥基肉桂酸，對苯二酚，黃烷醇，黃酮醇和花青素[19]，不同品種和部位的酚類含量差異較大。研究共檢測到3 種羥基肉桂酸（綠原酸，咖啡酸和對香豆酸），綠原酸是主要的種類，這與前人研究結果相似[20]。其中，尖把梨的果皮和果肉均檢測到較高含量的綠原酸。綠原酸具有多種有益健康的特性，例如抗氧化，抗炎，抗血脂和抗糖尿病等[21]。熊果苷是梨果實中的特有物質[9]，果皮中熊果苷含量高于果肉，其中京白梨的果皮熊果苷含量最高。秋子梨果實中主要的黃烷醇為表兒茶素，是梨原花青素的主要組成單元[22]。黃烷醇對果實品質具有重要意義，其含量直接影響果實風味[23]。在果皮和果肉中，尖把梨的黃烷醇含量均為最高，而京白梨的含量最低。黃酮醇是另一種重要的類黃酮化合物，根據KOLNIAK-OSTEK[19]的報道，黃酮醇在梨果皮中的含量高于果肉，這與本研究結果一致。花青素僅在南果梨和紅花蓋的果皮中檢測到，其含量與前人研究結果接近[24]。

酚類物質與抗氧化能力之間存在顯著相關性[25]。LI等[26]研究了10 種海棠果的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)總酚和總黃酮的濃度與DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力值顯著相關。本研究中也發(fā)現(xiàn)了類似結果，總酚含量和總黃酮含量高的品種顯示出比其他品種更高的抗氧化能力。因此，可以推斷酚類和類黃酮化合物對梨果實的抗氧化能力起主要作用。

抗變性測定是檢查抗炎活性的簡便方法，熱變性蛋白在誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應方面與天然蛋白一樣有效[27]。在本試驗中，6種梨的果皮提取物和果肉提取物均表現(xiàn)出良好的抗炎活性。另一方面，梨果實提取物具有較高的抑菌活性，但這種活性只在白梨[28]和西洋梨[29]中被報道過。本研究首次證明了秋子梨果實提取物具有較高的抑菌活性。

本研究通過對6 個秋子梨品種的果皮和果肉中的糖酸、酚類成分及其生物活性進行研究，結果表明，果肉中的糖含量明顯高于果皮，而抗氧化能力、抑菌效果和酚類含量則呈現(xiàn)相反的趨勢?？寡自囼灲Y果表明，6 個秋子梨品種的果皮和果肉提取物均具有較強的抗炎活性。抑菌試驗表明，果皮與果肉提取物均顯示出較強的抑菌活性，但果皮提取物的抑菌效果更好。不同品種的秋子梨成分和生物活性差異顯著，本研究將為這些品種的功能性物質利用奠定基礎。