根際Ca2+對(duì)番茄灰霉病抗性的影響

孫佳星 ，婁 琦，彭雅慧，玉 藍(lán)，黃文婷，李琳琳

（1.大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連116600；2.吉林市園藝特產(chǎn)技術(shù)中心，吉林吉林132000）

灰霉病是我國設(shè)施番茄生產(chǎn)中的重要病害，主要由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所引起，可危害番茄葉、莖、果實(shí)等部位，傳播性強(qiáng)，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。實(shí)際生產(chǎn)中多采用化學(xué)藥劑預(yù)防和控制病害，并發(fā)揮了重要的作用，但近年來由于化學(xué)農(nóng)藥造成的環(huán)境污染和人們對(duì)食品安全的擔(dān)憂日益突出。通過生物誘導(dǎo)物質(zhì)激活植物自身免疫系統(tǒng)是一種更為主動(dòng)、安全、經(jīng)濟(jì)、廣譜、持久、有效的抗性反應(yīng)方式，其研究受到人們的廣泛關(guān)注，具有重要的理論研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[2]。

水楊酸（SA）是植物中普遍存在的小分子酚類物質(zhì)，是重要的植物激素和抗病信號(hào)分子，SA 的積累標(biāo)志著植物免疫系統(tǒng)的激活，它還可以迅速的傳遞到植物其他部位產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗性（SAR）[3-4]。SA依賴型的抗性反應(yīng)對(duì)病原物普遍有效(包括真菌、細(xì)菌和病毒)，擬南芥通過抗氧化酶基因OXR2 激活植物體內(nèi)SA 的積累，提高對(duì)丁香假單胞菌的抗性[4]。又如SA提高PR1的表達(dá)提高早熟禾對(duì)褐斑病的抗性[5]。

鈣是植物生長發(fā)育過程中一種重要的營養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)發(fā)揮重要作用。有研究表明鈣可激發(fā)植物對(duì)病原菌的抗性，包括產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)、過敏性反應(yīng)和病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫[6]。施用鉀和鈣可顯著降低甜羅勒的百霉病[7]；2%～3%的CaCl2對(duì)生姜青枯病具有很好的抑制效果[8]；葉片外施鈣可通過調(diào)控ROS響應(yīng)大豆核菌侵染[9]；小麥細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的波動(dòng)可引起CDPK的表達(dá)提高對(duì)白粉病的抗性[10]；土壤施鈣可以有效提高番茄葉片鈣含量和PAL、PPO 活性，提高其對(duì)枯萎病的抗性[11]，這說明Ca2+在防治植物病害方面的積極作用，并有可能通過ROS、提高防御酶活性、改變細(xì)胞代謝途徑及鈣相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)控植物抗病。

前人分別在鈣和SA 誘導(dǎo)的生物脅迫中展開了大量研究，但目前關(guān)于鈣對(duì)SA 調(diào)控設(shè)施番茄的抗病性研究為數(shù)不多。本試驗(yàn)以L402 番茄為試材，以前期試驗(yàn)篩選確定的補(bǔ)鈣濃度為基礎(chǔ)，研究根際Ca2+對(duì)番茄幼苗SA含量、灰霉病抗性、防御酶活性和基因表達(dá)水平的影響。為進(jìn)一步研究鈣對(duì)SA 誘導(dǎo)抗病的作用機(jī)制和生產(chǎn)上開發(fā)新的生物抗病試劑奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄（Lycopersicon esculenturnMill）品種為L402，屬于灰霉病敏感型。供試灰霉菌(Botrytis cinerea)由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所惠贈(zèng)，病菌培養(yǎng)基為PDA。

1.2 方法

試驗(yàn)于2018年4月20日進(jìn)行，番茄種子經(jīng)55℃溫水處理10 min后，于30℃水溫浸種4h，然后置光照培養(yǎng)箱中28℃催芽，選擇出芽一致的種子，進(jìn)行32孔穴盤普通基質(zhì)育苗。番茄幼苗長到4葉1心時(shí)洗根移植到溫度處理室中的1/2 Hoagland營養(yǎng)液中適應(yīng)7d。溫度處理室由自動(dòng)控溫系統(tǒng)G IC-Ⅲ型溫室環(huán)境智能化控制器(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)工廠化農(nóng)業(yè)中心研制)按白天25℃、夜間15℃調(diào)控溫度；采用自然光照；控制器控制排風(fēng)扇實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)濕度，相對(duì)濕度為60%～70%。其他進(jìn)行常規(guī)管理。

番茄幼苗適應(yīng)7d 后（番茄幼苗長至 5 葉1 心）進(jìn)行Ca2+處理：T0 處理（對(duì)照，Ca2+濃度3mmol·L-1）、T1 處理（Ca2+濃度為8mmol·L-1）、T2 處理（Ca2+濃度為0mmol·L-1）。正常Hoagland 營養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)Ca2+濃度為 3mmol·L-1，8mmol·L-1Ca2+濃度是在標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營養(yǎng)液基礎(chǔ)上使用CaCl2調(diào)節(jié)營養(yǎng)液中Ca2+濃度，0mmol·L-1Ca2+濃度是在標(biāo)準(zhǔn)Hoagland 營養(yǎng)液[12]基礎(chǔ)上使用KNO3代替Ca(NO3)2剔除Ca2+并補(bǔ)充營養(yǎng)液中N 的濃度。營養(yǎng)液使用HCl和NaOH調(diào)節(jié)營養(yǎng)液中pH值達(dá)5.8～6.3，平均3d測定1次營養(yǎng)液的離子濃度和pH值。

Ca2+處理3d 后接種灰霉菌?；颐咕捎面咦討乙航臃N法，鏡檢調(diào)節(jié)孢子懸液濃度為4×106個(gè)孢子·mL-1懸液均勻噴施植株葉片背面，直到滴水為止。接種前保濕24h，接種后48h 內(nèi)保持濕度達(dá)100%并進(jìn)行遮陰，溫度設(shè)置為25℃/15℃。于接種6，12，24，48，72，96h 取樣進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測定。接種5d 后調(diào)查發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù)。每個(gè)處理10株，3次重復(fù)。

1.2.1 發(fā)病情況調(diào)查和病情指數(shù)的計(jì)算 灰霉病發(fā)病程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)，無病斑；1級(jí)，病斑面積占葉面積5%以下；3級(jí)，病斑面積占葉面積5%～15%；5級(jí)，病斑面積占葉面積15%～25%；7級(jí)，病斑面積占葉面積25%～50%；9級(jí)，病斑面積占葉面積50%以上。采用分級(jí)計(jì)數(shù)法計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.2 游離態(tài)SA含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的測定 SA的提取和測定參照YALPANI等[13]方法略有改進(jìn)。游離態(tài)SA含量用高效液相色譜(HPLC)測定。超氧陰離子產(chǎn)生速率過氧化氫（H2O2）含量的測定參照PATTERSON等[14]的方法略有改進(jìn)。

1.2.3 鈣含量的測定 稱取烘干樣品使用馬弗爐進(jìn)行灰化，使用原子吸收分光光度計(jì)測定鈣含量[15]。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶活性測定 使用pH值8.8的0.1mol·L-1硼酸-硼砂緩沖液研磨番茄葉片，離心后上清液為酶粗提液，以37 ℃保溫前后每小時(shí)酶促反應(yīng)產(chǎn)物反式肉桂酸生成量來表示PAL酶活。β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶酶活性根據(jù)BOLLER等[16]的方法略有改進(jìn)，以每秒分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-9mol N-乙酰葡萄糖胺量為一個(gè)酶活力單位；β-1，3-葡聚糖酶活性測定利用DNS試劑測定生成還原糖的量來表示。蛋白質(zhì)含量測定采用BRADFORD[17]的方法，用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白含量，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.5 RNA提取和RT-PCR基因表達(dá)分析 根據(jù)NCBI發(fā)表的番茄PR1、CDPK、CaM、CBL和Actin基因片段的序列，使用primer Primer 5.0軟件進(jìn)行特異引物設(shè)計(jì)，使用TianGen RNA提取試劑盒提取的RNA，作為模板使用Takara PrimeScript Reverse Transcriptase 合成cDNA第一鏈（表1）。根據(jù)KIM等[18]的方法采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)進(jìn)行表達(dá)量分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers of quantitative real time PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進(jìn)行整理和作圖，不同處理間差異的顯著性采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行Duncan’n多重比較分析（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際Ca2+對(duì)番茄幼苗抗病性的影響

由圖1 可知，本試驗(yàn)3 個(gè)根際Ca2+濃度處理?xiàng)l件下接種灰霉菌，其中，8mmol·L-1Ca2+處理的病情指數(shù)為36.05，3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理的病情指數(shù)分別為42.50 和73.24。Ca2+濃度越高病情指數(shù)越低，抗病效果越好，且不同Ca2+處理間的抗病性差異達(dá)到極顯著水平。

2.2 根際Ca2+對(duì)番茄幼苗體內(nèi)游離態(tài)SA含量的影響

由圖 2 可知，與對(duì)照相比，在 8mmol·L-1Ca2+處理?xiàng)l件下，游離態(tài)SA 含量在接種6h 增加到157.54 ng·g-1FW，并一直（6～96h）保持相對(duì)較高的水平；其含量在 24～96h 分別高于對(duì)照 2.0～2.5 倍。0mmol·L-1和3mmol·L-1處理的游離 SA 含量低于 8mmol·L-1Ca2+處理，且0mmol·L-1Ca2+處理游離SA含量低于對(duì)照。

圖1 不同根際Ca2+濃度處理番茄幼苗接種灰霉菌的病情指數(shù)Figure 1 The disease index of different rhizosphere Ca2+con‐centration treated tomato seedlings after Botrytis cinerea infec‐tion

2.3 根際Ca2+處理對(duì)接種灰霉菌后番茄幼苗和H2O2含量的影響

H2O2含量在8mmol·L-1Ca2+處理的番茄葉片接種灰霉菌 0～24h 劇烈的升高，明顯高于 3mmol·L-1和 0mmol·L-1Ca2+處 理 ，其 高 峰 出 現(xiàn) 在 24h，分 別 是 3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理的1.75和2.94倍；24～96 h劇烈的降低，在48h降低到3mmol·L-1的83%，0 mmol·L-1Ca2+處理的1.40倍。對(duì)照的H2O2含量在接種期間始終高于0mmol·L-1Ca2+處理。

圖2 根際Ca2+處理接種灰霉菌對(duì)番茄幼苗葉片游離態(tài)SA含量的影響Figure 2 The effect of rhizosphere Ca2+ treatments on the free SA content in tomato seedling leaves inoculated with Botrytis cinerea

2.4 根際Ca2+處理對(duì)接種灰霉菌后番茄幼苗鈣含量和防御酶活性的影響

由表2可知，在8mmol·L-1Ca2+處理?xiàng)l件下番茄體內(nèi)鈣含量顯著高于3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理，分別是二者的1.24 倍和1.86 倍。所有處理葉片PAL 活性均隨時(shí)間延長而升高，但升高趨勢不同。處理6 h 時(shí)，0 mmol·L-1Ca2+處理的番茄葉片PAL 活性與對(duì)照相比上升37.73%，到12～96 h，0mmol·L-1Ca2+處理植株P(guān)AL 活性始終低于對(duì)照；在8mmol·L-1Ca2+處理中，PAL 活性始終高于對(duì)照，并顯著高于0mmol·L-1Ca2+處理，且在處理24h活性最高，分別是3mmol·L-1和0 mmol·L-1Ca2+處理的2.63倍和3.82倍。

所有處理幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均是迅速升高而后緩慢下降的過程。對(duì)照的幾丁質(zhì)酶活性高峰出現(xiàn)在處理后48h，8 mmol·L-1Ca2+處理酶活高峰出現(xiàn)在處理后24h，0mmol·L-1Ca2+處理酶活高峰出現(xiàn)在處理后72h，分別為1.66U·mg-1protein、1.90U·mg-1protein 和1.23U·mg-1protein；8mmol·L-1Ca2+處理酶活較對(duì)照和0mmol·L-1Ca2+處理分別提高了14.45%和54.47%。在整個(gè)處理期間幾丁質(zhì)酶活性8mmol·L-1Ca2+處理高于對(duì)照，對(duì)照顯著高于0 mmol·L-1Ca2+處理。β-1,3-葡聚糖酶活性在12～96h 期間3 個(gè)處理間差異顯著，在處理6～24h 酶活均迅速上升，24～48h 達(dá)到酶活高峰，48～96 h 酶活保持相對(duì)穩(wěn)定略有下降。8mmol·L-1Ca2+處理的β-1,3-葡聚糖酶活性在處理后24h到達(dá)高峰，為117.73U·mg-1protein，顯著高于3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理，分別是 3mmol·L-1和 0mmol·L-1Ca2+處理的 1.24 倍和 1.40 倍。0mmol·L-1Ca2+處理的 β-1,3-葡聚糖酶活性高峰在24h出現(xiàn)，為84.07U·mg-1protein，對(duì)照的酶活高峰出現(xiàn)在48h，為103.44U·mg-1protein。

表2 不同根際Ca2+處理接種灰霉菌對(duì)番茄葉片鈣含量和防御酶活性的影響Table 2 The effect of rhizosphere Ca2+ treatments on calcium content, defense enzyme activities in tomato seedling leaves inoculated with Botrytis cinerea

2.5 根際Ca2+對(duì)番茄幼苗接種灰霉菌后鈣結(jié)合蛋白基因和病程相關(guān)蛋白1基因表達(dá)的影響

由圖4可知，鈣結(jié)合蛋白基因CDPK、CaM、CBL的表達(dá)模式均是先升高后緩慢降低的趨勢，其中CDPK的表達(dá)高峰出現(xiàn)在接種后 12h，8mmol·L-1Ca2+處理的表達(dá)量是 3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理的 2.44 倍和 4.45 倍；與對(duì)照和0mmol·L-1Ca2+處理相比，8mmol·L-1Ca2+處理的CDPK 表達(dá)水平在接種24～96 h均保持相對(duì)較高水平。CaM的表達(dá)量在 3 個(gè)處理中均升高，在 8mmol·L-1Ca2+處理下高峰出現(xiàn)在 24 h，分別為 3mmol·L-1和 0mmol·L-1Ca2+處理的2.41倍、1.17倍；0mmol·L-1Ca2+處理下6～48hCaM的表達(dá)量均高于對(duì)照。CBL基因在8mmol·L-1Ca2+處理?xiàng)l件下接種灰霉菌后迅速升高并一直保持較高表達(dá)水平，3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理?xiàng)l件下則是在6～24h升高，48h迅速下降后基本保持表達(dá)量穩(wěn)定。Ca2+濃度越高PR1基因表達(dá)量越高，在接種灰霉菌后24 h表達(dá)量最高為26.01，分別為3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理的1.60倍和3.17倍。整體看接種灰霉菌0～96 h過程中PR1的表達(dá)量為：8mmol·L-1處理 ＞ 3mmol·L-1處理＞ 0mmol·L-1處理。

3 討論與結(jié)論

3.1 Ca2+對(duì)番茄灰霉病抗性和SA含量的影響

Ca2+和SA 在防治植物病害方面有積極的作用。ARFAOUI 等[9]對(duì)大豆外施鈣可顯著抑制核菌的侵染；不同Ca2+處理可顯著降低生姜的青枯病的發(fā)病率[8]，CLARK 等[19]則認(rèn)為真菌的侵染可能是植物缺Ca2+的間接結(jié)果。植物體內(nèi)SA 含量的提高可被視為植物提高抗病性的一種標(biāo)志。DU 等[20]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可以調(diào)控?cái)M南芥水楊酸的積累和對(duì)病原物的抗性；擬南芥中CBP60（一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白）與Ca2+聯(lián)合起來促進(jìn)SA 的積累提高病原抗性[21]。本試驗(yàn)中根際8mmol·L-1Ca2+處理中，番茄葉片中游離態(tài)SA含量明顯升高、病情指數(shù)均顯著低于3mmol·L-1Ca2+處理；而 3mmol·L-1Ca2+處理番茄幼苗 SA 含量高于 0mmol·L-1Ca2+處理；病情指數(shù)又低于 0mmol·L-1Ca2+處理。隨著根際Ca2+處理濃度升高，植物體內(nèi)鈣含量也隨之升高。證明根際補(bǔ)充Ca2+具有顯著提高番茄抗灰霉病的能力。筆者認(rèn)為一方面因?yàn)檠a(bǔ)充的Ca2+被植物吸收，增強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，提高植物細(xì)胞對(duì)病原菌侵染的抵御能力。另一更重要方面是Ca2+促進(jìn)SA合成提高番茄對(duì)灰霉病的抗性。

圖4 根際Ca2+對(duì)番茄幼苗接種灰霉菌后鈣相關(guān)基因和病程相關(guān)蛋白基因1表達(dá)的影響Figure 4 The effect of rhizosphere Ca2+ treatments on calcium related genes and PR1 expression level in tomato seedling leaves inoculated with Botrytis cinerea

3.2 Ca2+對(duì)ROS和防御酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響

ROS 的爆發(fā)繼而引起防御酶（PAL、幾丁質(zhì)和β-1,3-葡聚糖）活性升高。PAL 是產(chǎn)生抗病物質(zhì)丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶[24-25]。本試驗(yàn)中不同根際鈣處理PAL 活性均隨時(shí)間延長而升高，8mmol·L-1Ca2+處理PAL 活性始終高于對(duì)照。馮軍等[24]研究發(fā)現(xiàn)SA 可有效誘導(dǎo)草莓PAL 的積累，進(jìn)而增強(qiáng)草莓抵御白粉菌侵染的能力，與本研究結(jié)果一致。β-1, 3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶可水解真菌細(xì)胞壁是植物抗病重要指標(biāo)。SCHNEIDERMüLLER 等[26]發(fā)現(xiàn)，用殼聚糖處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，除去胞外Ca2+明顯降低誘導(dǎo)物對(duì)幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)作用；SA 處理番茄幼苗后幾丁質(zhì)酶，β-1,3-葡聚糖酶活性明顯提高[27]，本試驗(yàn)中β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性在根際Ca2+處理接種灰霉菌后均顯著升高，8mmol·L-1Ca2+處理幾丁質(zhì)酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性顯著高于3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理。在0mmol·L-1Ca2+處理中，鈣含量、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性降到最低水平，且與Ca2+濃度和游離態(tài)SA 含量呈正相關(guān)關(guān)系。筆者認(rèn)為Ca2+促進(jìn)SA 積累，Ca2+和SA共同激發(fā)ROS導(dǎo)致PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的提高。

植物細(xì)胞中有Ca2+/CDPK、Ca2+/CaM 和Ca2+/CBL 3種主要的鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它們均可以與Ca2+結(jié)合與植物抗逆反應(yīng)密切相關(guān)[28]。如在柑橘潰瘍病抗性的SNP 篩選中發(fā)現(xiàn)與抗病相關(guān)的CDPK基因上調(diào)表達(dá)[28]；在PEG 6000 滲透脅迫下，Ca2+/CaM 調(diào)控SA 誘導(dǎo)的小桐子幼苗甜菜堿積累[29]；TaCIPK31 在小麥抵抗葉銹菌侵染過程中起負(fù)調(diào)控作用[30]。本試驗(yàn)分析了鈣結(jié)合蛋白基因CDPK、CaM、CBL的表達(dá)情況，其中CDPK和CaM的表達(dá)水平高于CBL，且CDPK和CaM的表達(dá)模式與防御酶活性和PR1的表達(dá)模式一致，說明CDPK和CaM與番茄對(duì)灰霉菌抗性密切相關(guān)，與張娜等的研究結(jié)果相似[30]。PR1基因是SA 抗病信號(hào)途徑的標(biāo)志性基因[7]，PR1基因的表達(dá)受SA、JA、病原菌、礦質(zhì)元素等多種物質(zhì)誘導(dǎo)[7]，本試驗(yàn)也與前人研究結(jié)果一致，但8mmol·L-1Ca2+處理的PR1基因的表達(dá)水平高于3mmol·L-1和0mmol·L-1Ca2+處理，說明Ca2+促進(jìn)SA的積累，并與SA一同進(jìn)一步提高了8mmol·L-1Ca2+條件下PR1的表達(dá)水平。

綜上所述，根際8mmol·L-1Ca2+處理后接種灰霉菌降低番茄的病情指數(shù)，提高抗病性，促進(jìn)ROS 的爆發(fā)，提高番茄幼苗體內(nèi)游離態(tài)SA含量，SA和ROS共同提高了PAL、幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶活性和PR1表達(dá)水平；Ca2+結(jié)合蛋白基因CDPK和CaM受不同根際鈣處理影響且與抗病密切相關(guān)；根際Ca2+提高番茄抗灰霉病效果顯著。