綠茶加工中主要脂溶性色素變化及其對(duì)茶葉色澤品質(zhì)的影響

舒娜，汪蓓，歐陽(yáng)珂，孟慶，童華榮

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

干茶色澤是綠茶的第一感官因子[1]，也是茶葉加工過(guò)程中評(píng)定在制品質(zhì)量的重要參考依據(jù)。脂溶性色素是綠茶干茶色澤的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，主要包括葉綠素和類胡蘿卜素[2]。葉綠素屬吡咯類綠色色素，是影響綠茶干茶綠色色澤的重要成分[3]。類胡蘿卜素是指一類具有黃色到橙紅色的多種有色化合物，是構(gòu)成干茶黃色色澤的主要因子[4]，同時(shí)對(duì)茶葉的香氣品質(zhì)有積極影響[5]。目前茶葉中已發(fā)現(xiàn)41種葉綠素和38種類胡蘿卜素[6]，但由于缺乏有關(guān)脂溶性色素組分與綠茶干茶色澤的相關(guān)性研究，難以表征各色素組分對(duì)干茶色澤品質(zhì)的作用。

目前測(cè)定茶葉中脂溶性色素的方法有分光光度法[7]、薄層色譜法[8]和液相色譜法[9]等。分光光度法定量準(zhǔn)確性和靈敏度偏低[10]，薄層色譜法鑒定的色素組分有可能是混合物且耗時(shí)久[11]，目前多采用高效液相色譜法檢測(cè)茶葉中脂溶性色素[6,9,12]。但國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)茶葉中脂溶性色素的方法大多存在分離效果不夠理想，可測(cè)定色素種類少等問(wèn)題[12-13]。ZAPATA等[14]通過(guò)使用C8反向色譜柱，并在流動(dòng)相中添加吡啶/醋酸溶液以改善峰形所建立的脂溶性色素分析方法具有分離度好，可鑒定組分多等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)際上對(duì)其應(yīng)用日益增多[15-17]，但在國(guó)內(nèi)的茶學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用尚不廣泛[18]。

加工工藝對(duì)綠茶脂溶性色素的影響較大[1]。研究表明，綠茶加工中脂溶性色素在酶、熱和機(jī)械外力等因素的作用下發(fā)生降解，生成一系列葉綠素和胡蘿卜素的衍生物[11]。殺青是形成綠茶“清湯綠葉”品質(zhì)的關(guān)鍵工序，同時(shí)也是葉綠素降解形成脫鎂葉綠素最顯著的階段[19]。揉捻對(duì)條形綠茶的葉綠素含量影響不大[20]，但增加揉捻壓力和次數(shù)會(huì)增大葉綠素的破壞率[21]。類胡蘿卜素含量在綠茶加工過(guò)程中顯著下降，特別是經(jīng)殺青和干燥后降幅分別達(dá)到52%和67%[6]。干燥方式對(duì)脂溶性色素影響較大，冷凍干燥和微波干燥處理有利于減少綠茶葉綠素和β-胡蘿卜素等脂溶性色素的損失[12]。提香是綠茶加工中提升茶葉香氣品質(zhì)的重要工序[19,22]，但在提高香氣的同時(shí)，較難保證綠茶“三綠”的色澤品質(zhì)要求[23]。目前鮮見(jiàn)有關(guān)提香工序?qū)χ苄陨亟M分及干茶色澤影響的研究。

本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器 (high performance liquid chromatography with photodiode array detection, HPLC-PDA) 對(duì)綠茶加工過(guò)程中在制品的脂溶性色素進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用色差儀監(jiān)測(cè)在制品外觀色澤的變化，旨在闡明脂溶性色素在綠茶加工中的變化規(guī)律及其與干茶色澤的內(nèi)在聯(lián)系，探究影響綠茶色澤的關(guān)鍵色素成分，為綠茶色澤品質(zhì)的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

茶鮮葉原料：巴渝特早，一芽一葉，2018年9月采于重慶市巴南區(qū)。

黃體素(98%)、玉米黃素(98%)、β-胡蘿卜素(98%)，上海源葉生物科技有限公司；葉綠素a(90%)、葉綠素b(90%)，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；脫鎂葉綠素a(95%)，美國(guó)Frontier Scientific公司；丙酮、甲醇、乙腈、無(wú)水吡啶、冰乙酸，均為色譜純，成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

M20A高效液相色譜儀，日本島津公司；Ultra Scan PRO測(cè)色儀，美國(guó) Hunter Lab 公司；雷磁pHS-25型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；5810R冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

鮮葉原料加工成綠茶毛茶的工藝如下：

攤青(室溫，10 h)→殺青(320 ℃，1 min)→揉捻(室溫，空壓10 min-輕壓10 min-重壓30 min-輕壓10 min)→干燥(110 ℃，20 min)

加工過(guò)程樣采用液氮固樣，冷凍干燥后粉碎過(guò)40目篩密封。樣品均置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個(gè)樣品重復(fù)取樣3次。

選取生產(chǎn)上常用的3個(gè)提香溫度，即80、100、120 ℃對(duì)綠毛茶進(jìn)行提香處理，其中80 ℃提香，每隔60 min取樣，共計(jì)6次，樣品分別編號(hào)T101、T102、T103、T104、T105、T106；100 ℃提香每隔45 min取樣，共計(jì)6次，樣品分別編號(hào)T201、T202、T203、T204、T205、T206；120 ℃提香每隔30 min取樣，共計(jì)6次，樣品分別編號(hào)T301、T302、T303、T304、T305、T306。提香制得的樣品粉碎過(guò)40目篩后裝入密封袋，置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，每個(gè)樣品重復(fù)取樣3次。

1.2.2 色素提取與HPLC分析條件

準(zhǔn)確稱取0.100 g樣品于預(yù)先冷卻的研缽中，加入80% 丙酮水溶液(-4 ℃)2 mL研磨至勻漿狀，經(jīng)冷凍離心(-20 ℃，4 000 r/min，10 min)后轉(zhuǎn)移上清液。重復(fù)上述操作，合并上清液，定容至5 mL，過(guò)0.45 μm有機(jī)膜，注入樣品瓶待測(cè)。HPLC分析條件參考文獻(xiàn)ZAPATA等[14]、鄧春梅等[24]的方法，并根據(jù)實(shí)際情況做適當(dāng)修改。色譜柱：Waters C8柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相A：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(吡啶/醋酸溶液)=50∶25∶25；流動(dòng)相B：V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(丙酮)=20∶60∶20；吡啶/醋酸溶液的配制如下：20 mL吡啶溶于900 mL超純水，緩慢滴加醋酸直到pH值變?yōu)?.0，隨后用超純水定容到1 L；流速為1 mL/min，柱溫箱溫度25 ℃；梯度洗脫程序：0-22-28-38-40 min，0%B-40%B-95%B-95%B-0% B；進(jìn)樣體積：10 μL：檢測(cè)波長(zhǎng)340～740 nm。

1.2.3 色素組分定性定量分析

參考SUZUKI等[6]及陳麗等[18]的試驗(yàn)結(jié)果中的保留時(shí)間和特征吸收波長(zhǎng)對(duì)色譜峰進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線如表1所示。各組分在430 nm 處均有一定強(qiáng)度的吸收峰，因此采用430 nm下的峰面積進(jìn)行定量計(jì)算。由于茶葉脂溶性色素種類繁多且大部分色素沒(méi)有商品化標(biāo)準(zhǔn)品出售，在本試驗(yàn)中沒(méi)有標(biāo)品的組分根據(jù)文獻(xiàn)[18,25]報(bào)道的替換計(jì)算方法進(jìn)行定量，即葉綠素a異構(gòu)體用葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，葉綠素b異構(gòu)體用葉綠素b標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，其余無(wú)標(biāo)品的葉綠素組分及類胡蘿卜素組分分別根據(jù)脫鎂葉綠素a和黃體素的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

表1 色素標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of pigments

1.2.4 干茶色差的檢測(cè)

采用L*-a*-b*表色系。取40目下的樣品粉末, 用測(cè)色儀測(cè)定其L*、a*、b*,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素和多因素方差分析；采用SIMCA 14.1進(jìn)行偏最小二乘分析；采用Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂溶性色素組分檢測(cè)結(jié)果

26個(gè)樣品經(jīng)HPLC-PDA檢測(cè)分析后共得到脂溶性色素成分28種(表2)，其中葉綠素12種，類胡蘿卜素16種，與其他液相色譜檢測(cè)方法[9,12]相比，此方法分離出了茶葉中更多的脂溶性色素組分。由于自然界中葉綠素及類胡蘿卜素的種類繁多，且存在多種同分異構(gòu)體，本試驗(yàn)中檢測(cè)到的色素組分特征吸收波長(zhǎng)相近，未能確定全部檢出色素的具體結(jié)構(gòu)。其中，未確定具體結(jié)構(gòu)的葉綠素及類胡蘿卜素分別用字母Y及C表示。

表2 葉綠素和類胡蘿卜的特征吸收波長(zhǎng)Table 2 Characteristic absorption wavelengths of chlorophylls and carotenoids

2.2 脂溶性色素在綠茶加工中的變化

葉綠素組分在毛茶加工中的變化如圖1所示。鮮葉中檢出Y1、Y2、葉綠素a和葉綠素b 4種葉綠素。攤放后新檢出葉綠素a′及脫鎂葉綠素a，殺青后新增組分包括葉綠素b′、脫鎂葉綠素a′、Y3、Y4及Y5。葉綠素總量在加工過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，相較鮮葉，在制品葉綠素總量經(jīng)攤青、殺青、揉捻及干燥后分別降低3.21%、9.73%、10.08%及13.73%。其中，葉綠素a(藍(lán)綠色)和葉綠素b(黃綠色)是茶鮮葉中2種主要的天然色素[2]，含量分別為335.61和146.41 μg/g，共占茶鮮葉葉綠素總量的92.3%。相較鮮葉，在制品葉綠素a和b的總量經(jīng)攤青、殺青、揉捻及干燥后分別降低16.12%、37.98%、39.38%及53.50%。這是由于在溫度、水分及外力等因素的影響下，葉綠素a和b發(fā)生脫鎂、水解和氧化反應(yīng)[19]導(dǎo)致其含量降低。葉綠素發(fā)生脫鎂反應(yīng)產(chǎn)生的脫鎂葉綠素呈現(xiàn)黑褐色澤，被認(rèn)為是造成茶葉發(fā)黑的主要物質(zhì)[26]。本研究中檢出2種脫鎂葉綠素，即脫鎂葉綠素a及脫鎂葉綠素a′。攤青葉中脫鎂葉綠素總量為11.29 μg/g，經(jīng)殺青、揉捻及干燥后其含量分別增加30.64%、37.08%及57.38%。因此，可知在綠毛茶加工過(guò)程中殺青和干燥工序是葉綠素a和b大量降解、脫鎂葉綠素迅速形成和積累的主要階段。

圖1 葉綠素在綠毛茶加工過(guò)程中的變化Fig.1 Trends of chlorophylls in green tea during processing注：圖中不同小寫字母表示樣品間差異顯著(P<0.05)(下同)

在毛茶加工過(guò)程中，類胡蘿卜素組分的變化如圖2所示。鮮葉中共檢出14種類胡蘿卜素，其中黃體素含量最高(231.60 μg/g)，其次是堇黃素(115.84 μg/g)和新黃素(64.36 μg/g)。由于類胡蘿卜素性質(zhì)不穩(wěn)定，在熱、光、氧等因素影響下易發(fā)生熱裂解和光解等反應(yīng)[10]，各類胡蘿卜素組分在綠茶加工中發(fā)生不同程度的降解。與葉綠素相似，殺青和干燥工序是類胡蘿卜素含量下降最為顯著的2個(gè)階段。相較于鮮葉，類胡蘿卜素總量經(jīng)殺青及干燥后分別降低27.80%和35.10%。其中，殺青后降幅最大的是C1(47.75%),其次是玉米黃素(45.18%)，堇黃素(39.79%)和C9(38.93%)。干燥后堇黃素降幅最高，達(dá)95.55%，此外，環(huán)氧玉米黃素、新黃素、C8和C9降幅均高于55%。鮮葉中含量最高的黃體素在各加工工序中無(wú)顯著性變化，干燥后其含量?jī)H減少3.24%。

圖2 類胡蘿卜素在綠毛茶加工過(guò)程中的變化Fig.2 Trends of carotenoids in green tea during processing

3個(gè)不同提香溫度處理下，在制品脂溶性色素種類及含量的變化過(guò)程如圖3所示。色素種類在提香過(guò)程中發(fā)生顯著變化，提香樣中未檢出環(huán)氧玉米黃素、C1、C5、C6及C8。在T1和T2處理中，新黃素、堇黃素、C2及C9隨提香時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸消失，T3中未檢出上述四類色素，新檢出原焦脫鎂葉綠酸a、C14和C15，其含量隨提香時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。在同一提香溫度下，在制品葉綠素和類胡蘿卜素總量隨提香時(shí)間的延長(zhǎng)均呈下降趨勢(shì)。提香180 min后，T1、T2和T3處理中葉綠素總量較毛茶樣(提香0 min)分別減少9.21%、11.22%及33.11%，其中葉綠素a和b的總量分別較少38.17%、44.35%及59.78%，而脫鎂葉綠素總量分別增加34.22%、37.48%及67.82%。類胡蘿卜素總量分別減少12.52%、16.92%、33.48%，其降解產(chǎn)物可能參與綠茶香氣品質(zhì)的形成[10,19]。

a-葉綠素組分；b-類胡蘿卜素組分圖3 葉綠素和類胡蘿卜在綠茶提香過(guò)程中的變化Fig.3 Trends of chlorophylls and carotenoids in green tea during baking

采用多因素方差分析探究提香溫度、提香時(shí)間及其交互作用對(duì)提香中在制品脂溶性色素含量的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，提香溫度和時(shí)間對(duì)所分析的15種色素含量均有極顯著影響(P<0.01)。提香溫度和時(shí)間的交互作用除對(duì)C2、玉米黃素及β-胡蘿卜素的含量無(wú)顯著影響外，對(duì)其余色素含量的影響均達(dá)到顯著或極顯著水平。從F值來(lái)看，提香溫度對(duì)各色素含量的影響程度均大于提香時(shí)間、提香溫度和時(shí)間交互作用的影響程度。

表3 綠茶提香過(guò)程中脂溶性色素的多因素方差分析結(jié)果Table 3 Multivariate ANOVA of lipophilic pigments in green tea during baking

2.3 在制品色度值在綠茶加工中的變化

干茶色度值在綠毛茶加工過(guò)程中的變化如圖4所示。L*代表亮度，在毛茶加工過(guò)程中L*呈下降趨勢(shì)，其中攤青和干燥處理后L*顯著降低，在制品色澤明顯變暗。揉捻后在制品亮度略有增加，可能與在制品的水分重新分布及內(nèi)含物質(zhì)穿透至表面有關(guān)[21]。a*代表紅綠度，正值代表顏色偏紅，負(fù)值代表顏色偏綠。在毛茶加工中a*保持負(fù)值，且呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明在制品色澤以綠色為主，但綠色色澤逐漸削弱，干燥后a*變化幅度最大。b*代表黃藍(lán)度，正值代表顏色偏黃，負(fù)值代表顏色偏藍(lán)。在毛茶加工中b*的變化規(guī)律與L*的較為一致，在制品表現(xiàn)為黃度降低。

圖4 在制品色度值在綠毛茶加工過(guò)程中的變化Fig.4 Trends of colorimetric values in green tea during processing

3個(gè)不同提香溫度處理下，在制品L*、a*和b*的變化過(guò)程見(jiàn)圖5。由圖5可知，在同一提香溫度下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，L*呈下降趨勢(shì)，a*呈上升趨勢(shì)，b*則在80 ℃中呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，100 ℃中呈現(xiàn)先波動(dòng)下降后波動(dòng)上升的變化趨勢(shì)，120 ℃中呈波動(dòng)上升趨勢(shì)。而在不同提香溫度下，整體上L*表現(xiàn)為80 ℃>100℃>120 ℃，a*和b*表現(xiàn)為80 ℃<100 ℃<120 ℃，表明隨著提香溫度的升高，在制品的亮度降低，綠色色澤減弱，黃色色澤增強(qiáng)。采用多因素方差分析進(jìn)一步研究提香溫度、提香時(shí)間及其交互作用對(duì)在制品色度值的影響，結(jié)果如表4所示。由表4可知，提香溫度和時(shí)間對(duì)L*、a*及b*均有極顯著影響。溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)L*和a*的影響達(dá)極顯著水平，而對(duì)b*無(wú)顯著影響。從F值來(lái)看，提香溫度對(duì)a*和b*的影響程度大于提香時(shí)間及溫度和時(shí)間的交互作用，提香時(shí)間對(duì)L*的影響程度略大于提香溫度的影響程度。

表4 綠茶提香過(guò)程中在制品色度值的多因素方差分析結(jié)果Table 4 Multivariate ANOVA of colorimetric values in green tea during baking

a-L*；b-a*；c-b*圖5 干茶色度值在綠茶提香過(guò)程中的變化Fig.5 Trends of colorimetric values in green tea during baking

2.4 在制品色澤與關(guān)鍵色素組分的相關(guān)性分析

根據(jù)色度值與脂溶性色素組分含量建立偏最小二乘回歸模型，分析色素組分與在制品色澤的相關(guān)性，并采用偏最小二乘回歸-變量投影重要性法(partial least squares regression-variable importance for projection, PLSR-VIP)篩選出影響綠茶色澤的關(guān)鍵色素組分[27]。以檢出的28種脂溶性色素含量為自變量X，各樣品的色度值為因變量Y。依次作3個(gè)因變量Y的偏最小二乘回歸，選擇因變量解釋度>80%的因子計(jì)算各自變量的VIP值。選擇VIP值>1的變量作為關(guān)鍵變量，優(yōu)化偏最小二乘回歸模型，并計(jì)算各關(guān)鍵變量與因變量的加權(quán)回歸系數(shù)，回歸系數(shù)的大小的絕對(duì)值與相關(guān)性成正比，選取回歸系數(shù)絕對(duì)值>0.1 的關(guān)鍵變量為顯著相關(guān)物質(zhì)[28]。

通過(guò)模型所包含的X和Y矩陣信息的百分比及預(yù)測(cè)能力三方面對(duì)所建模型進(jìn)行評(píng)價(jià)[29]。如表5所示，3個(gè)模型中的前2個(gè)主成分分別包含自變量X的信息均>90%，對(duì)因變量Y的解釋度均>82%，模型預(yù)測(cè)能力均>77%，說(shuō)明這些色素組分與色度值間關(guān)系密切，且PLSR法能夠較好預(yù)測(cè)二者間的關(guān)系。在亮度L*模型，有15個(gè)色素組分的VIP值>1，其中葉綠素b、C6、葉綠素a、C5和新黃素與L*呈顯著正相關(guān)，回歸系數(shù)均>0.15。與L*呈顯著負(fù)相關(guān)的組分有脫鎂葉綠素a及Y3，回歸系數(shù)均<-0.1，說(shuō)明隨著脫鎂葉綠素a及Y3含量的增加，在制品亮度降低，葉色發(fā)暗。在紅綠度a*模型中，VIP值>1的色素組分有14個(gè)，其中僅有脫鎂葉綠素a′和Y3與a*呈正相關(guān)。與a*呈顯著負(fù)相關(guān)的主要成分有Y1、葉綠素b和葉綠素a，回歸系數(shù)均<-0.1，說(shuō)明當(dāng)Y1、葉綠素b和葉綠素a含量越高時(shí)，a*越小，在制品綠色色澤越強(qiáng)，這與孫嬋駿[30]研究結(jié)果一致。在黃藍(lán)度b*模型中，VIP值>1的色素組分有15個(gè)，其回歸系數(shù)的絕對(duì)值較為接近，為0.057～0.067。其中回歸系數(shù)為正值的有堇黃素、環(huán)氧玉米黃素、新黃素、葉綠素a、C1、C5、C6和C8，表明在制品的黃色色澤可能是多個(gè)類胡蘿卜素綜合作用的結(jié)果。

表5 脂溶性色素在色度值PLSR模型中的加權(quán)回歸系數(shù)Table 5 Estimated regression coefficients from PLSR models of chromatic values

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)綠茶加工過(guò)程中在制品脂溶性色素的變化分析，發(fā)現(xiàn)在制品的葉綠素種類在殺青后顯著增加，類胡蘿卜素種類在提香過(guò)程中逐漸減少，葉綠素總量及類胡蘿卜素總量在加工中均呈下降趨勢(shì)。其中，在殺青和干燥工序中，高溫作用破壞了葉綠體結(jié)構(gòu)，葉綠素從蛋白體中釋放出來(lái)[2]，使呈綠色色澤的葉綠素大量降解，呈黑褐色澤的脫鎂葉綠素迅速生成并積累，同時(shí)呈黃色色澤的類胡蘿卜素在高溫下發(fā)生裂解[10]，含量顯著降低，導(dǎo)致在制品亮度顯著降低，綠色及黃色色澤顯著減弱。在提香工序的持續(xù)熱作用下，葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素進(jìn)一步損失，脫鎂葉綠素持續(xù)積累，在制品色澤逐漸變暗。多因素方差分析結(jié)果表明，提香溫度對(duì)各脂溶性色素含量、a*及b*的影響程度明顯大于提香時(shí)間的影響程度。因此，在加工中合理選擇殺青、干燥及提香溫度，嚴(yán)格控制在制品葉溫，以減少葉綠素等脂溶性色素的大量損失，是達(dá)到綠茶“三綠”品質(zhì)要求的有效途徑。

本研究基于PLSR-VIP法對(duì)28種脂溶性色素含量與在制品色度值的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明影響在制品L*、a*和b*的主要色素組分分別為15種、14種和15種。其中，與L*呈顯著正相關(guān)的色素為葉綠素b、C6、葉綠素a、C5和新黃素，呈顯著負(fù)相關(guān)的色素為脫鎂葉綠素a及Y3。與a*呈正相關(guān)的色素為脫鎂葉綠素a′及Y3，呈顯著負(fù)相關(guān)的色素為Y1、葉綠素b和葉綠素a。與b*呈正相關(guān)的色素組分包括7種類胡蘿卜素和1種葉綠素，表明在制品黃色色澤可能受多種類胡蘿卜素含量的影響。但在加工過(guò)程中多酚類氧化產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等的形成均會(huì)對(duì)干茶色澤產(chǎn)生一定影響[31-32]，后續(xù)可對(duì)這部分物質(zhì)對(duì)干茶色澤的作用做進(jìn)一步研究。