吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌的篩選和菌種鑒定

朱道洋，魏春雨，余曉斌

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)，作為許多細(xì)菌脫氫酶(甲醇脫氫酶，乙醇脫氫酶和葡萄糖脫氫酶等)的輔助因子于1964年首次被發(fā)現(xiàn)[1]，它是繼吡啶核苷酸和核黃素之后的第3種氧化還原酶的輔酶[2]。PQQ在生物界的分布極為廣泛，在動植物和微生物細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)其存在[3]，但僅有部分革蘭氏陰性細(xì)菌能合成PQQ[4-6]。在具有合成PQQ能力的細(xì)菌中，絕大部分只能合成痕量的PQQ以供給細(xì)胞生長，只有少部分可以生產(chǎn)過量的PQQ，并將其排泄到培養(yǎng)基中[7-8]，其中以甲基營養(yǎng)菌的合成能力最強，如甲基菌屬(Methylobacill)，甲基單胞菌屬(Methylomonas)，嗜甲基菌屬(Methylophilus)和甲基桿菌屬(Methylobacterium)等[9-12]。此外，在納豆、青椒和獼猴桃等植物體內(nèi)也含有微量的PQQ，并且牛奶和人類的母乳中也存在較高濃度的PQQ[13-16]。近幾十年來的研究發(fā)現(xiàn)PQQ具有多種生理功能，它是許多細(xì)菌脫氫酶的輔助因子，參與細(xì)胞的電子呼吸鏈傳遞[17]；PQQ可以提高微生物細(xì)胞的抗逆性，并提高宿主菌的抗氧化能力[18]；PQQ還是動植物刺激或生長因子[19]；此外，PQQ與葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase，GDH)結(jié)合形成PQQ-GDH全酶，可用作檢測葡萄糖的生物傳感器，也可用作生物燃料電池[20-21]。

由于目前PQQ化學(xué)合成步驟復(fù)雜，副產(chǎn)物多，而微生物發(fā)酵生產(chǎn)PQQ成本低，步驟少，產(chǎn)物分離更容易，因此微生物發(fā)酵法成為最有前景的工業(yè)化生產(chǎn)路線[22-23]。雖然對PQQ的研究已有幾十年，但其生物合成的具體過程尚未完全闡明，從環(huán)境中篩選高產(chǎn)野生菌依然是必不可少的。1992年，司振軍[9]篩選到1株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定為生絲微菌Hyphomicrobiumsp.TK0441，優(yōu)化培養(yǎng)基后在30 L發(fā)酵罐上發(fā)酵14 d后PQQ產(chǎn)量可達(dá)到1 g/L。SI等[22]從土壤中篩選到1株甲基營養(yǎng)菌，經(jīng)鑒定為Methylobacillussp.zju323,未經(jīng)優(yōu)化的PQQ搖瓶產(chǎn)量為23.2 mg/L，在已報道的研究中屬于高水平。本研究建立了一種高效液相色譜法用來快速檢測PQQ，從土壤樣品中篩選得到1株P(guān)QQ高產(chǎn)菌，并對其進(jìn)行了菌種鑒定和培養(yǎng)基優(yōu)化，為后續(xù)進(jìn)行PQQ的生產(chǎn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌樣品來自于無錫生產(chǎn)甲醇工廠附近的土壤和污水；PQQ標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；其他試劑，國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

G180T滅菌鍋，美國致微儀器有限公司；高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；Agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司。

1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：甲醇30 mg/L，(NH4)2SO43 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO41.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。固體培養(yǎng)基添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

種子培養(yǎng)基：甲醇10 mg/L，(NH4)2SO43 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO41.4 g/L，微量元素液 1 mL/L；微量元素液配方(mg/L)：CaCl2·2H2O 30，MnCl4·4H2O 5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1 mL維生素液;維生素液配方(mg/L)：核黃素200，對氨基苯甲酸200，鹽酸硫胺素400，煙酸400，鹽酸吡哆醇400，泛酸鈣400，葉酸2，生物素2，肌醇2 000。

1.4 實驗方法

1.4.1 PQQ產(chǎn)生菌初篩方法的確立

光譜法：對PQQ標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其在249和330 nm處有2個吸收峰，將200 μL PQQ標(biāo)準(zhǔn)品溶液或發(fā)酵離心上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測 OD330與 OD249，并將空白培養(yǎng)基以同樣的條件處理和檢測，從而減去培養(yǎng)基吸光值的干擾。

1.4.2 HPLC法檢測PQQ

由于PQQ的結(jié)構(gòu)上連有3個—COOH，因此易溶于水，極性較大，在普通的C18反相色譜柱上不保留。目前采用較多的是離子色譜對法來檢測PQQ，但是離子色譜對平衡時間長，操作復(fù)雜且對柱子也有局限性；還有采用加酸調(diào)節(jié)pH來使PQQ保留在色譜柱上，但這使得峰形拖尾嚴(yán)重并且重現(xiàn)性不好。為此本實驗選擇親水色譜柱來解決PQQ難以在色譜柱上保留的問題。以水為流動相，通過COSMOSIL Packed Column 5 C18-PAQ反相色譜柱，測定PQQ在249和330 nm的吸光值，根據(jù)出峰面積確定其濃度。利用安捷倫1260系列高效液相色譜儀測定PQQ含量，進(jìn)樣量20 μL，溫度30 ℃，流動相為V(0.05 mol/L乙酸)∶V(0.05 mol/L乙酸銨)=30∶70，流速1 mL/min，在249和330 nm下檢測PQQ標(biāo)準(zhǔn)品和樣品含量。

1.4.3 菌株的篩選

將樣品制成適當(dāng)濃度梯度的稀釋液，涂布于甲醇篩選培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，分別挑取不同形態(tài)的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min 培養(yǎng)3～5 d，將發(fā)酵液離心取上清液，用光譜法快速檢測PQQ含量，再用HPLC法對PQQ產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.4.4 菌種的鑒定

將PQQ產(chǎn)量最高的菌株在固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，利用普通光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。取單菌落接種到搖瓶培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600為0.5～1時，取3 mL發(fā)酵液，10 000 r/min 離心1 min，棄去上清液，收集菌體，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，利用細(xì)菌通用引物 27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，通過PCR反應(yīng)擴增該菌株的16S rDNA序列，將產(chǎn)物委托上海生工測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行BLAST比對，用軟件MEGA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.4.5 甲醇含量對菌體生長和PQQ產(chǎn)量的影響

對培養(yǎng)基中的唯一碳源甲醇進(jìn)行優(yōu)化，研究甲醇的不同添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，3%、3.5%和4%，體積分?jǐn)?shù))對菌體生長和PQQ產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜法檢測PQQ

研究建立了基于光譜法檢測PQQ的快速篩選方法，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)PQQ在249和330 nm左右有2個吸收峰?？紤]到發(fā)酵液中含有蛋白，核酸等在249 nm左右有吸收值的物質(zhì)，而在330 nm處有吸收值的物質(zhì)較少，因此，本實驗選擇研究PQQ濃度和OD330的關(guān)系。通過酶標(biāo)儀檢測不同濃度 PQQ標(biāo)準(zhǔn)品的OD330(檢測樣品時要減去空白發(fā)酵培養(yǎng)基的吸光值以除去干擾)，發(fā)現(xiàn)在330 nm下PQQ濃度與OD330關(guān)系為y=0.021 8x-0.035 4(R2=0.995 7)。當(dāng)PQQ質(zhì)量濃度在2.5～50 mg/L時，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，由于野生菌產(chǎn)PQQ量多在1～20 mg/L左右，因此使用本方法進(jìn)行高通量篩選的初篩具有良好的可行性。

2.2 HPLC法檢測PQQ

本實驗首先研究了其他色譜柱檢測PQQ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通C18柱無法使PQQ有效保留，更換流動相甲醇和乙腈，或者是梯度洗脫都不能保留PQQ。另外發(fā)現(xiàn)改變pH可以使PQQ有所保留，但峰形較差，且拖尾嚴(yán)重，并且不能很好地分離樣品發(fā)酵液中的PQQ。考慮到PQQ極性較大，因此采用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱來使PQQ有很好的保留。將準(zhǔn)備好的7個不同質(zhì)量濃度的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品(100、50、25、12.5、6.125、5和2.5 mg/L)進(jìn)行HPLC檢測，每個質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣20 μL。結(jié)果如圖1所示，不同濃度的PQQ均在3.56 min左右出峰。隨著PQQ濃度的增加，峰面積也逐漸增加。因此PQQ濃度與峰面積呈正相關(guān)的關(guān)系。以PQQ濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系為y=30.27x+7.32，R2=0.999 8，說明線性關(guān)系良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱檢測PQQ，運行時間短，PQQ出峰時間早，檢測效率高。本實驗建立的HPLC法檢測PQQ具有良好的可行性，可作為菌種產(chǎn)PQQ的復(fù)篩方法。

圖1 不同濃度PQQ標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC測定Fig.1 The HPLC determination of PQQ standards with different concentrations

2.3 菌株的篩選和鑒定

經(jīng)光譜法初篩，從100多個樣品中篩選到50多株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，大多數(shù)的產(chǎn)量在2～5 mg/L，少數(shù)可以達(dá)到10 mg/L左右，HPLC復(fù)篩后其中PQQ產(chǎn)量最高的1株為20.6 mg/L，峰圖如圖2所示，PQQ在3.57 min出峰，這是未經(jīng)優(yōu)化已報道的搖瓶較高產(chǎn)量。

圖2 Methylopila sp.Z1發(fā)酵液的HPLC圖Fig.2 The HPLC chart of the fermentation broth of Methylopila sp.Z1

該菌株的菌落在甲醇培養(yǎng)基平板上為乳白色，黏稠，邊緣整齊，直徑較小，為1～2 mm。菌體細(xì)胞為球狀，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，有莢膜，無鞭毛。該菌株在以甲醇和甲胺為碳源的培養(yǎng)基中能夠良好生長，能利用D-葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖。在以銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中能良好生長。采用PCR技術(shù)擴增該菌株的16S rDNA 基因序列，經(jīng)上海生工測序。通過在 NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行同源性序列搜索及比對，從中選取同源性較高菌株的16S rDNA基因序列，以集團外菌種作對照，通過MEGA軟件，用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖3所示，該菌株與Methylopilahenanensisstrain LYBFD3-16A2的同源性最高，為99%。綜合菌落及菌體形態(tài)特征、16S rDNA序列分析， 鑒定該菌株為Methylopilasp.菌株，命名為Methylopilasp.Z1。

圖3 Methylopila sp. Z1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of Methylopila sp.Z1

2.4 甲醇含量的優(yōu)化

研究甲醇的不同添加量(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%,體積分?jǐn)?shù))對OD600和PQQ產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。在0.5%～2.5%，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的提高，菌體OD600和PQQ產(chǎn)量也逐漸提高，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.5%時，OD600和PQQ產(chǎn)量均達(dá)到最高，繼續(xù)增加甲醇，OD600和PQQ產(chǎn)量均有明顯下降。這是因為甲醇作為細(xì)菌生長的唯一碳源，并且還是細(xì)菌細(xì)胞甲醇脫氫酶的底物，在其濃度較低時，不足以提供能量使細(xì)胞生長，也無法生產(chǎn)過量的PQQ排泄到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致PQQ合成效率非常低。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)逐漸提高時，細(xì)胞所能利用的碳源增加，菌體OD600和PQQ產(chǎn)量也逐漸增加；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)超過2.5%時，由于甲醇的毒性使細(xì)胞損傷，并且底物濃度過高抑制甲醇脫氫酶的活性，導(dǎo)致菌體OD600和PQQ產(chǎn)量下降。因此甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.5%對于菌體生長和PQQ合成是最佳選擇。

圖4 不同甲醇濃度對PQQ合成和生物量的影響Fig.4 Effect of different methanol concentration on PQQ synthesis and biomass

3 結(jié)論

目前PQQ的檢測方法主要有重組酶法，氧化還原法，光譜法和HPLC[24]，其中重組酶法所用到的葡萄糖脫氫酶提取繁瑣，純化過程復(fù)雜，且得到的酶活不高，不足以支持大量的菌種篩選；氧化還原法中用到的顯色劑氯化硝基四氮唑藍(lán)易受培養(yǎng)基中其他成分的干擾，造成陰性結(jié)果。光譜法操作簡單，檢測快速，但也可能受到培養(yǎng)基中具有相似波長吸光度的影響，但本實驗采用的是甲醇無機培養(yǎng)基，并通過HPLC檢測樣品發(fā)現(xiàn)基本沒有干擾，因此光譜法作為PQQ產(chǎn)生菌的初篩是高效可行的。本實驗還建立了新的HPLC法檢測PQQ，采用親水色譜柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，使得PQQ有很好的保留，并且樣品運行時間短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時間早，檢測時間短，峰形無拖尾，為PQQ檢測提供一種新的改進(jìn)方法。

由于PQQ的生物合成機理沒有得到完全闡釋，通過基因工程和代謝改造提高PQQ的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于野生菌的產(chǎn)量，因此從環(huán)境中篩選具有高產(chǎn)PQQ能力的菌種是十分必要的。本實驗從樣品中篩選到1株P(guān)QQ高產(chǎn)菌，經(jīng)鑒定為Methylopilasp.，命名為Methylopilasp.Z1，未經(jīng)優(yōu)化的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到20.6 mg/L，屬于已報道的較高水平。Z1菌株耐受較高甲醇，在培養(yǎng)基甲醇體積分?jǐn)?shù)為2.5%時，PQQ產(chǎn)量達(dá)26.7 mg/L，相比于初始濃度提高了28%。Z1是一株有高產(chǎn)PQQ潛力的菌株，后續(xù)發(fā)酵罐培養(yǎng)和優(yōu)化工藝將進(jìn)一步提高PQQ產(chǎn)量。