桑葚果渣固態(tài)發(fā)酵醋有機(jī)酸及風(fēng)味特征分析

吳震，吳煜樟，陳莉，汪沙，李榮源，盧紅梅*

1(貴州大學(xué), 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

桑葚又名桑果、桑葚子、桑烏等，口味甜中略酸，富含花青素、多酚、氨基酸、有機(jī)酸等營養(yǎng)成分，具有重要的研究與開發(fā)價(jià)值[1-3]。然而新鮮的桑葚不易存放，通常用于加工果汁、果酒等產(chǎn)品，在此過程中會產(chǎn)生大量的果渣，這些果渣中仍殘留著花青素、多酚等有效物質(zhì)，多數(shù)情況下被用作肥料或作為垃圾傾倒填埋，造成了環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[4]。桑葚果樹在生長過程中需要定期剪枝修葉，桑葉作為中醫(yī)傳統(tǒng)藥材，含有多糖、黃酮、生物堿等活性成分，因此對桑葚果渣及桑葚果園的廢棄桑葉進(jìn)行回收并加以利用具有較大的潛在價(jià)值和應(yīng)用前景[5]。

果醋是以果品或果品加工下腳料為主要原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)釀制的酸性飲品或調(diào)味品，具有抗氧化、抗疲勞、降糖降脂等多種功效[6]。果醋的生產(chǎn)主要以鮮果榨汁進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵獲得，但由于原料的單一性使產(chǎn)品口感和風(fēng)味受到了一定的限制。采用固態(tài)發(fā)酵制備果醋可以改善產(chǎn)品風(fēng)味和色澤，更容易被消費(fèi)者接受。

本實(shí)驗(yàn)以桑葚果渣為主要原料、桑葉為輔料，采用固態(tài)發(fā)酵方式制備桑葚果渣醋，以常規(guī)液態(tài)發(fā)酵的桑葚果醋作為對照，對產(chǎn)品的理化指標(biāo)以及發(fā)酵過程中有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析，旨在為桑葚副產(chǎn)物資源化利用提供新思路，增加桑葚產(chǎn)品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母BV818，湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋酸菌GIM1.158，廣東省微生物菌種保藏中心。

桑葚果汁、果渣、桑葉，貴州省開陽縣某有限公司；桑葉用水清洗，60 ℃條件下烘干并打碎至10～20目備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；酒石酸，成都金山化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸、乳酸、草酸、檸檬酸、乙酸，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；L-蘋果酸、琥珀酸，麥克林生化科技有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus BT氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國力可公司；高效液相色譜儀(配置G1329B自動進(jìn)樣器、G1311C四元低壓梯、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列紫外-可見光檢測器)、ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國安捷倫公司；722 s可見分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司；ZD-2A自動電位滴定儀，上海大普儀器有限公司；LD-3D離心機(jī)，上海上登實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 果醋生產(chǎn)方法

1.3.1 桑葚果醋釀造工藝

固態(tài)發(fā)酵桑葚果渣醋工藝如下：

液態(tài)發(fā)酵桑葚果汁醋工藝如下：

1.3.2 操作要點(diǎn)

(1)菌種活化與培養(yǎng)

酵母菌活化：稱取活性干酵母于含糖量為20 g/L的糖水中，在37 ℃下活化25 min。

醋酸菌活化：將斜面保藏菌種接種至基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1%葡萄糖，1%酵母膏，3.5%無水乙醇,均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)),在30 ℃，150 r/min條件下培養(yǎng)48 h制備1級種子液，再將1級種子液以10%接種量制備2級種子液。

(2)調(diào)配、酒精發(fā)酵

果渣組在添加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))桑葚汁后與果汁組分別加入蔗糖調(diào)整至總糖含量為14%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，以干酵母0.4 g/L的添加量加入酵母活化液，于26 ℃條件下發(fā)酵至酒精度和還原糖含量趨于衡定。

(3)醋酸發(fā)酵

果渣組添加輔料后與果汁組接入12%(體積分?jǐn)?shù))醋酸菌種子液，于32 ℃條件下發(fā)酵至總酸含量和酒精度趨于衡定(果渣組每24 h攪拌1次醋醅，果汁組采用150 r/min搖瓶發(fā)酵)。

(4)淋醋及滅菌[7]

醋醅與水按質(zhì)量比1∶1.2浸泡7～9 h，再稱取新醋醅浸泡到頭醋液中，反復(fù)套淋3次，所得醋液過濾后于70 ℃下滅菌25 min。

1.4 產(chǎn)品品質(zhì)分析

1.4.1 理化指標(biāo)測定

總酸含量(以乙酸計(jì))測定[8]參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》；不揮發(fā)酸含量(以乳酸計(jì))測定[9]參照GB 18187—2000《釀造食醋》；多酚含量[10]采用福林酚法測定，分別以吸光值和沒食子酸濃度為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.012 4x+0.006 6(R2=0.999 0)；黃酮含量[11]參照GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》分別以吸光值和蘆丁濃度為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.442 1x+0.003 4(R2=0.999 1)。

1.4.2 有機(jī)酸測定[12]

取樣：(1)果醪：添加果汁及蔗糖后的桑葚果渣醪；(2)酒醪：桑葚果渣酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)的醪液；(3)果渣醋：桑葚醋醅所淋醋液；(4)果汁醋：桑葚果酒醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)醋液。

樣品處理：取樣品10 mL以4 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜待測。測定條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速：0.00～4.00 min流速為1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。

選取草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品配成一定濃度梯度混合進(jìn)樣，以各種有機(jī)酸的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析[13-14]

取5.0 mL液體樣品(或5.0 g固體樣品)于頂空瓶中，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動儀器采集數(shù)據(jù)。GC條件：DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，起始溫度40 ℃，初始時(shí)間3 min；然后以10 ℃/min升至230 ℃，保留5 min。MS條件：發(fā)射電流1 mA；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃。各種化合物相對含量采用歸一化法計(jì)算獲得。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office 2016、Origin 2017、SPSS 26.0、RStudio等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚果醋理化指標(biāo)分析

由表1可知，桑葚果渣醋的總酸含量低于桑葚果汁醋，這可能是由于發(fā)酵周期較長所造成的部分損失以及固態(tài)釀造的淋醋工藝所致。不揮發(fā)酸是衡量食醋品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，其作用在于調(diào)和食醋酸味，桑葚果渣醋中不揮發(fā)酸含量高于桑葚果汁醋，可以使果醋口感更加柔和、具有回味[15]。桑葚果渣醋的總酚和總黃酮含量分別達(dá)到桑葚果汁醋的1.5和1.7倍，具有顯著性差異(P<0.05)，桑葉是多酚、黃酮等抗氧化物質(zhì)的有效來源，許多品種的桑葉均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，推測桑葚果渣醋中較高含量的多酚、黃酮與桑葉的添加有關(guān)[16]。

表1 不同桑葚果醋理化指標(biāo)檢測結(jié)果 單位：g/L

2.2 桑葚果醋的有機(jī)酸組成

表2列舉了桑葚果渣醋不同發(fā)酵階段樣品中7種有機(jī)酸的含量。在果渣醋的發(fā)酵過程中，草酸、酒石酸、蘋果酸含量呈逐漸降低的趨勢，乳酸和檸檬酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與陸燕等[17]在利用桑葚汁制備果醋研究中的變化一致。乙酸在醋酸發(fā)酵前變化較小，經(jīng)過醋酸菌代謝后逐漸增加，最終達(dá)到45.83 g/L。琥珀酸是酵母代謝的重要產(chǎn)物，是果渣醋發(fā)酵過程中唯一呈上升趨勢的有機(jī)酸。

表2 不同桑葚樣品中有機(jī)酸含量 單位：g/L

由表2可知，桑葚果渣醋和果汁醋的有機(jī)酸組成存在較大差異，果醋的口感與不揮發(fā)酸含量及占比存在一定關(guān)聯(lián)，果渣醋中較高比例的乳酸、檸檬酸、琥珀酸等不揮發(fā)酸能調(diào)和果醋酸味，減少乙酸對味覺的刺激，使得果醋口感更加柔和[18]。除乙酸和酒石酸外，果渣醋中其他有機(jī)酸含量均高于果汁醋，這可能與輔料的添加以及微生物代謝情況的差異有關(guān)。

2.3 桑葚果醋及固態(tài)發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)分析

2.3.1 桑葚樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對含量對比分析

采用GC-MC法從固態(tài)發(fā)酵的桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及液態(tài)發(fā)酵的桑葚果汁醋樣品中共檢測出264種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。對4種桑葚樣品各類風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如圖1所示。

a-種類對比圖；b-相對含量對比圖圖1 桑葚樣品中風(fēng)味物質(zhì)分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Substance classification statistics of flavor substances in mulberry samples

桑葚果醪、酒醪、果渣醋中分別檢測出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)105、145、132種，桑葚果渣醋發(fā)酵過程風(fēng)味物質(zhì)種類呈先增加后減少的趨勢，這與管冠宇[19]在液態(tài)發(fā)酵制備桑葚果醋的研究中風(fēng)味物質(zhì)變化趨勢一致。酯類物質(zhì)的相對含量始終占有較高比例，果醋中的酯類多具有較高的氣味活性值(odor activity value，OAV)，如乙酸異戊酯(OAV=56，呈香蕉香味，果渣醋中相對含量為1.81%)、己酸乙酯(OAV=8.7，呈菠蘿香味，果渣醋中相對含量為2.31%)等，均對果醋整體的香氣產(chǎn)生積極的貢獻(xiàn)[20]。果醪與酒醪中酸類物質(zhì)組成較為接近，醋酸發(fā)酵后酸類物質(zhì)的種類及相對含量明顯增加，其中乙酸從6.92%增加到30.21%，異戊酸、己酸、乳酸等均為這一階段所產(chǎn)生。醇類物質(zhì)相對含量變化較大，酒精發(fā)酵后增加9.59%，這一階段酵母菌產(chǎn)生大量乙醇，同時(shí)產(chǎn)生正己醇、異戊醇、異丁醇等大量高級醇副產(chǎn)物；醋酸發(fā)酵階段減少11.53%，主要為醋酸菌代謝消耗以及大量醇類物質(zhì)與酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)造成[21]。醛酮類物質(zhì)在發(fā)酵過程中變化較小，其中苯甲醛、3-羥基-2-丁酮含量較高，苯甲醛貢獻(xiàn)蜜甜香，后者在食醋中較為常見，具有奶香味[22]。烴類物質(zhì)主要以烷烴為主，酒精發(fā)酵后烴類物質(zhì)增加了33種，隨后減少到12種，但相對含量始終較低。

果汁醋中共檢測出86種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以酸類、酯類和醇類物質(zhì)為主，除醛類外，果渣醋中各類風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量均大于果汁醋，這表明桑葚果渣醋具有更加豐富的香氣成分。LU等[23]對比了以液態(tài)發(fā)酵和半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)胡柚果醋的品質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)半固態(tài)發(fā)酵樣品風(fēng)味物質(zhì)種類更多，推測可能是輔料的添加或微生物代謝情況不同所致。果渣醋的酯類物質(zhì)種類較果汁醋多出18種，但相對含量卻略低于果汁醋，其中乙酸異戊酯相對含量最高，其次是乙酸苯乙酯；而果汁醋中相對含量最高的是乙酸乙酯，其次是乙酸異戊酯。乙酸異戊酯具有香蕉氣味，乙酸苯乙酯帶有玫瑰香，乙酸乙酯則具有令人愉悅的果香[24]。酸類是果醋的主體風(fēng)味物質(zhì)，果渣醋和果汁醋中乙酸相對含量分別為30.21%和30.70%，異戊酸、乳酸等酸類物質(zhì)可以使果醋酸味更加豐富、柔和。2種果醋中醇類物質(zhì)呈現(xiàn)種類少、相對含量高的特點(diǎn)，其中苯乙醇、異戊醇含量豐富，苯乙醇賦予果醋玫瑰花香、蜂蜜味，異戊醇則具有白蘭地酒香，它們使得果醋風(fēng)味濃郁、風(fēng)格更加突出[25]。

為繼續(xù)探究不同桑葚樣品中風(fēng)味物質(zhì)結(jié)構(gòu)的異同，利用Upset Plot將桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中風(fēng)味物質(zhì)的重疊情況進(jìn)行可視化處理，如圖2所示。

圖2 桑葚樣品中風(fēng)味物質(zhì)的Upset plot分析Fig.2 Upset Plot analysis of flavor substances in mulberry samples

在檢測出的264種風(fēng)味物質(zhì)當(dāng)中，4種桑葚樣品共同存在34種風(fēng)味物質(zhì)，表明果醪、酒醪、果渣醋和果汁醋的風(fēng)味特征具有一定的相似性。如果將僅出現(xiàn)在某一樣品中的風(fēng)味物質(zhì)稱為“特征成分”，則4種桑葚樣品的特征成分?jǐn)?shù)量呈酒醪>果渣醋>果醪>果汁醋的關(guān)系，這與其各自所含風(fēng)味物質(zhì)種類的數(shù)量關(guān)系一致，果渣醋與果汁醋的特征成分分別為50種和16種，進(jìn)一步說明以固態(tài)發(fā)酵所得的桑葚果渣醋具有更加復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)結(jié)構(gòu)及風(fēng)格特征。此外，僅果醪、酒醪和果渣醋中共同檢測出的風(fēng)味物質(zhì)有辛酸甲酯、苯乙醛等17種，表明這些物質(zhì)主要來源于桑葚果渣，且發(fā)酵過程中保留效果較好。僅果渣醋和果汁醋中共同檢測出的風(fēng)味物質(zhì)有正癸醛、α-松油醇等7種，這些物質(zhì)可能是對桑葚果醋風(fēng)味特征貢獻(xiàn)較大的成分。

由此可見，以桑葚果渣固態(tài)發(fā)酵制備果醋相較于液態(tài)桑葚醋具有更加豐富的風(fēng)味物質(zhì)，因此，本研究繼續(xù)探究桑葚果渣醋發(fā)酵過程中主要風(fēng)味物質(zhì)組成并進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2.3.2 桑葚果醋固態(tài)發(fā)酵過程中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA

桑葚果渣固態(tài)發(fā)酵過程中果醪、酒醪、果渣醋中相對含量大于1%的風(fēng)味物質(zhì)(表3)主要有乙酸、乙酸乙酯、苯乙醇等22種成分，對這22種成分進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖3所示。

表3 桑葚果渣醋發(fā)酵過程中樣品相對含量>1%的風(fēng)味物質(zhì) 單位：%

圖3 桑葚發(fā)酵過程中樣品主要風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析Fig.3 PCA of the main flavor substances of samples during the fermentation of mulberry pomace vinegar

由圖3可知，PC1主要與異丁醇、庚酸乙酯、乙醛等物質(zhì)呈正相關(guān)，與乙酸、乳酸、乙酸苯乙酯等呈負(fù)相關(guān)，其中異丁醇對PC1貢獻(xiàn)最大，發(fā)酵過程中呈逐漸下降的趨勢。PC2主要與正己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇等物質(zhì)呈正相關(guān)，與己酸、異戊醇、正己醇等呈負(fù)相關(guān)，其中正己酸乙酯對PC2貢獻(xiàn)最大，發(fā)酵過程中呈先升高后降低的趨勢。果醪、酒醪、果渣醋分別位于第四、第一、第三象限，表明發(fā)酵過程中樣品的主要風(fēng)味物質(zhì)組成產(chǎn)生了較大變化。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用固態(tài)發(fā)酵方式，以桑葚果渣為原料、桑葉為輔料制備桑葚果醋。分析表明，桑葚果渣醋的總酸含量為49.84 g/L，不揮發(fā)酸、總酚、總黃酮含量分別為7.25、2.72、2.16 g/L，均高于桑葚果汁醋。在果渣醋發(fā)酵過程中，草酸、酒石酸、蘋果酸含量降低，琥珀酸含量升高，果渣醋中草酸、乳酸、琥珀酸含量明顯高于果汁醋。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)從桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中分別檢測出105、145、132、86種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，相較于果汁醋，果渣醋的風(fēng)味物質(zhì)更加豐富，風(fēng)格特征更加明顯。主成分分析表明，桑葚果渣醋在不同發(fā)酵階段主要風(fēng)味物質(zhì)結(jié)構(gòu)存在較大差異。

上述分析結(jié)果表明以桑葚果渣及桑葉固態(tài)發(fā)酵制備果醋具有可行性。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)桑葚果渣醋中總酚及總黃酮含量均高于桑葚果汁醋，這可能意味著桑葚果渣醋具有更強(qiáng)的抗氧化活性，后續(xù)將針對桑葚果渣醋功能性成分以及保健功效進(jìn)行研究，為桑葚副產(chǎn)物利用提供更充分的理論依據(jù)。