萍鄉(xiāng)搓菜復(fù)合發(fā)酵菌劑的研究

曹余，鄧澤元，魏長(zhǎng)浩，余誠(chéng)瑋，李紅艷*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047) 2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330031)

萍鄉(xiāng)搓菜是江西萍鄉(xiāng)傳統(tǒng)的蔬菜干腌制品，其制作工藝已有上百年的歷史。萍鄉(xiāng)搓菜在制作的過程中不添加食用鹽，亞硝酸鹽含量低，相比于傳統(tǒng)發(fā)酵的泡菜、酸菜等產(chǎn)品更能滿足人們對(duì)低鹽健康食品的追求[1]。同時(shí)，由于搓菜產(chǎn)品是使用半干的蔬菜發(fā)酵而成，故其含水量較低，更利于保存和運(yùn)輸。但目前多是以自然發(fā)酵的方式生產(chǎn)，受自然條件因素影響很大，且耗時(shí)數(shù)月，極大地限制了搓菜的工業(yè)化生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)效益，因此，研究搓菜發(fā)酵所需的最佳菌劑配比，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)搓菜尤為重要。

早期已有研究人員將Lactobacillusplantarum∶Pichiakudriavzevii=1∶3混合投入發(fā)酵搓菜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)投入復(fù)合發(fā)酵菌劑后可降低搓菜中亞硝酸鹽含量，且風(fēng)味物質(zhì)種類與自然發(fā)酵相似，僅含量上略有差別[2]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，從自然發(fā)酵搓菜中分離篩選出多株優(yōu)勢(shì)菌種，通過研究各菌株的發(fā)酵性能及菌種間相互作用，將Lactobacillusbuchneri、Lactobacillussunkii、L.plantarum、Lactobacillusbrevis、P.kudriavzevii、Kazachstaniabulderi以不同配比發(fā)酵搓菜，對(duì)比自然與人工菌劑發(fā)酵搓菜的品質(zhì)，選擇出最佳發(fā)酵菌劑配比，以求在保證發(fā)酵搓菜品質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步縮短搓菜的發(fā)酵周期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芥菜，南昌市上海北路菜市場(chǎng)；C5～C10、C10～C25正構(gòu)烷烴，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；葡萄糖等培養(yǎng)基用試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基，YPD液體培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中加0.04%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))溴甲酚紫，YPD固體培養(yǎng)基。

鑒定培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，硝酸鹽培養(yǎng)基，產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)培養(yǎng)基，吲哚培養(yǎng)基；碳源同化培養(yǎng)基，氮源同化培養(yǎng)基，產(chǎn)類淀粉培養(yǎng)基，無維生素培養(yǎng)基。

1.3 儀器與設(shè)備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；TA-XT plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司；3nh高精度色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司；單重四級(jí)桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌種的篩選

用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋搓菜樣品，取不同稀釋度涂布于初篩平板，倒置培養(yǎng)48 h，取平板上形態(tài)不同的菌落，分別在初篩培養(yǎng)基上劃線分離，重復(fù)分離3～4次，鏡檢后于-20 ℃甘油保藏。

1.4.2 菌種的鑒定

1.4.2.1 生理生化鑒定

乳酸菌鑒定方法[3-4]：革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、產(chǎn)H2S試驗(yàn)、pH 4.5生長(zhǎng)試驗(yàn)、糖或醇發(fā)酵試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)。

酵母菌鑒定方法[5-6]：糖發(fā)酵試驗(yàn)、碳源同化試驗(yàn)，氮源同化試驗(yàn)、無維生素生長(zhǎng)試驗(yàn)、37 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉試驗(yàn)。

1.4.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過生理生化鑒定初步判定后，進(jìn)行基因測(cè)序鑒定，主要步驟為：提取DNA，PCR擴(kuò)增，切膠純化測(cè)序，拼接序列，最后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將同源性較高的典型菌株的序列用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.3 發(fā)酵搓菜用菌種的篩選

1.4.3.1 菌種間相互作用的分析

菌種間拮抗實(shí)驗(yàn)采用牛津杯法[7]。

1.4.3.2 乳酸菌產(chǎn)酸能力的測(cè)定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》，每4 h測(cè)酸度(以乳酸計(jì))和pH值。

1.4.3.3 酵母菌耐酸能力的測(cè)定

在初始pH值為2、3、4、5、6的YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)菌液在600 nm處的OD值。

1.4.4 菌種內(nèi)最佳配比的探究

1.4.4.1 發(fā)酵菌株菌種內(nèi)配比的探究

將乳酸菌和酵母菌進(jìn)行菌種內(nèi)復(fù)配，20 ℃下培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定混合菌液在600 nm處的OD值，分別取酵母菌和乳酸菌菌種內(nèi)配比生長(zhǎng)狀況較好的前3組，按酵母菌與乳酸菌3∶1的比例混合，以1%接種量接種于半干芥菜上，20 ℃發(fā)酵50 d，與自然發(fā)酵的產(chǎn)品對(duì)比。

1.4.4.2 質(zhì)構(gòu)與色澤的測(cè)定

質(zhì)構(gòu)：采用直徑為5 mm的圓柱形探頭進(jìn)行質(zhì)地多面分析(texture profile analysis，TPA)實(shí)驗(yàn)[8]。測(cè)試參數(shù)為：測(cè)前速度1 mm/s，測(cè)試速度1 mm/s，測(cè)后速度1 mm/s，壓縮程度40%，2次壓縮間隔時(shí)間為5 s，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g。

色澤：使用色度計(jì)測(cè)定搓菜的色澤[9]，記錄L*、a*、b*值，總色度C*的計(jì)算如公式(1)所示：

C*=(a2+b2)1/2

(1)

1.4.4.3 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

邀請(qǐng)10名感官評(píng)價(jià)參與者對(duì)10種產(chǎn)品進(jìn)行綜合打分[10]。

1.4.5 發(fā)酵搓菜風(fēng)味物質(zhì)的分析

萃取條件:取4 g剪碎的搓菜，置于15 mL頂空瓶中，45 ℃下預(yù)熱30 min，將頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction，HS-SPME)萃取頭插入萃取瓶中，45 ℃萃取30 min，拔出萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口，解吸5 min。

色譜條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始柱溫35 ℃，保持3 min，5 ℃/min線性升溫至100 ℃保持2 min，10 ℃/min線性升溫至220 ℃保持15 min。載氣為He，流量1 mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV，電離源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍50～550 u。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

利用C5～C10、C10～C25正構(gòu)烷烴為混標(biāo)計(jì)算各化合物的保留指數(shù)(retention index，RI)對(duì)化合物進(jìn)行定性，用面積歸一法計(jì)算百分含量。采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)，采用SPSS 25統(tǒng)計(jì)軟件，以P<0.05為顯著性差異。采用Excel 2016進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選與鑒定

從自然發(fā)酵搓菜中分離篩得7種不同菌落形態(tài)的菌種，生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示，菌種系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

表1 乳酸菌生理生化實(shí)驗(yàn)Table 1 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

表2 酵母菌生理生化實(shí)驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical experiments of yeast

由生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定得Y1為P.kudriavzevii、Y2為K.bulderi、R1為L(zhǎng).buchneri、R2為L(zhǎng).sunkii、R3為L(zhǎng).Alimentarius、R4為L(zhǎng).plantarum、R5為L(zhǎng).brevis，7株菌均為發(fā)酵蔬菜中的常見菌株。NGVYEN等[11]研究越南發(fā)酵蔬菜中乳酸菌組成，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌占比達(dá)17.1%，短乳桿菌占比0.5%。LIU等[12]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵芥菜的塊莖中L.Alimentarius豐度達(dá)85.8%。LIU等[13]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵泡菜中大量存在P.kudriavzevii和K.bulderi。

2.2 發(fā)酵搓菜用菌種的篩選

2.2.1 菌種間的相互作用

酵母菌和乳酸菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R3與R1、R2、R4之間均有拮抗作用(R3菌液抑制R2、R4生長(zhǎng)，R1菌液抑制R3生長(zhǎng))。研究表明，乳酸鏈球菌與保加利亞乳桿菌或干酪乳桿菌混合培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)相互拮抗作用，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間也有明顯的拮抗作用[14]。本實(shí)驗(yàn)中，R3與R1、R2、R4之間有拮抗作用，可能是R3在生長(zhǎng)的過程中產(chǎn)生某種酶或者細(xì)菌素對(duì)其他菌種生長(zhǎng)有抑制作用。由菌種生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)結(jié)果可知，R3菌體密度最小，且與另外3株乳酸菌之間有拮抗作用，故R3將不被選為發(fā)酵菌劑菌種。

a-乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹；b-酵母菌系統(tǒng)發(fā)育樹圖1 菌種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of strains

2.2.2 乳酸菌產(chǎn)酸能力的測(cè)定

乳酸菌產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱與其自身耐酸能力強(qiáng)弱相關(guān)，一般來說，菌種產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，耐酸能力也越強(qiáng)?？焖俅罅慨a(chǎn)酸不僅能快速抑制雜菌生長(zhǎng)，保證產(chǎn)品質(zhì)量，還能使產(chǎn)品快速達(dá)到發(fā)酵效果，縮短發(fā)酵時(shí)間[15]。由圖2可知，各菌種在生長(zhǎng)過程中酸度變化與pH變化結(jié)果相符，R1、R4、R5產(chǎn)酸能力相近，且較R2強(qiáng)，故在發(fā)酵菌種配比中將R1、R4、R5以1∶1∶1配比，并將其視為一個(gè)整體與R2進(jìn)行配比。

a-pH;b-酸度圖2 乳酸菌生長(zhǎng)過程中pH和酸度變化Fig.2 Variations of pH and acidity during the growth of lactic acid bacteria

2.2.3 酵母菌耐酸能力的測(cè)定

在乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵體系中，酵母菌的耐酸能力決定它能否在體系中正常生長(zhǎng)。由圖3可知，2株酵母菌對(duì)于低pH均有良好的耐受性，在pH值為2的條件下，酵母菌OD600nm值仍在0.4左右，且Y1在pH值為5時(shí)有最大菌體密度，此結(jié)果與劉春燕[16]研究結(jié)果相似。

圖3 酵母菌在不同pH條件的生長(zhǎng)情況Fig.3 Yeast growth at different pH conditions

2.3 菌種內(nèi)最佳配比的探究

2.3.1 發(fā)酵菌株菌種內(nèi)配比的探究

由圖4可知，當(dāng)乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3、2∶3時(shí)，菌體密度相對(duì)較高。在同一生長(zhǎng)體系中，當(dāng)多株菌種混合培養(yǎng)時(shí)，菌體密度相對(duì)較高，說明混合菌生長(zhǎng)狀態(tài)較好。因此選擇乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3和2∶3進(jìn)行后續(xù)菌種間配比試驗(yàn)。

a-乳酸菌;b-酵母菌圖4 乳酸菌和酵母菌菌種內(nèi)配比Fig.4 Interspecific ratios of yeast and lactic acid bacteria注：不同字母表示具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.3.2 質(zhì)構(gòu)與顏色的測(cè)定

由圖5可知，2、6、7、9及自然發(fā)酵組的質(zhì)構(gòu)結(jié)果相對(duì)較好，且2、6、7、9組的黏結(jié)性、咀嚼性、彈性均高于或持平于自然發(fā)酵組，6、7組的硬度與自然發(fā)酵組持平。從質(zhì)構(gòu)角度看，加入適宜比例的菌劑后，搓菜的品質(zhì)有所改善，可能是由于適宜比例的菌劑能夠使菌群生長(zhǎng)代謝維持平衡，從而減弱搓菜組織細(xì)胞的破壞程度及細(xì)胞壁原果膠的水解程度，最終使發(fā)酵搓菜的咀嚼性、彈性、黏結(jié)性較好[17-18]。搓菜經(jīng)發(fā)酵后，從顏色亮度和總色度上可看出6、7、9和自然發(fā)酵組較好，這兩者反映的是搓菜顏色的飽滿度及鮮亮度，亮度越高說明顏色越鮮亮，褐變的程度越小[19]。

2.3.3 感官評(píng)定

由感官評(píng)定結(jié)果可知，1、2、6、7組的總評(píng)分較高，感官評(píng)定色澤結(jié)果與色度計(jì)測(cè)定結(jié)果有略微差異，可能是由于各參評(píng)人員感官閾值有所不同。綜合質(zhì)構(gòu)與色度結(jié)果可看出6、7組發(fā)酵效果最好，且其感官評(píng)定總評(píng)分高于自然發(fā)酵組。由于第6組感官評(píng)價(jià)總評(píng)分高于第7組，因此最終選定第6組菌種配比為最終搓菜復(fù)合發(fā)酵菌劑配比。最終發(fā)酵菌劑配比為酵母菌Y1∶Y2=1∶2，乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=3∶2。

表3 感官評(píng)價(jià)結(jié)果表Table 3 Results of sensory evaluation

2.4 發(fā)酵搓菜風(fēng)味物質(zhì)的分析

利用HS-SPME-GC-MS測(cè)定了自然發(fā)酵與優(yōu)選菌劑發(fā)酵搓菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如圖6所示。

a-硬度；b-黏結(jié)性；c-咀嚼性；d-彈性；e-亮度；f-總色度圖5 發(fā)酵搓菜的質(zhì)構(gòu)與色澤Fig.5 The texture and colors of fermented Cuocai注：分組1，3，4，5，5，7，8，9分別表示YI∶Y2、(R1/R4/R5)∶R2為1∶3、2∶1，1∶3、3∶1，1∶3、3∶2,1∶2、2∶1，1∶2、3∶1,1∶2、3∶2，2∶3、2∶1,2∶3、3∶1，2∶3、3∶2，自然發(fā)酵組表示未接種菌劑

a-種類數(shù)量；b-相對(duì)含量圖6 不同組搓菜產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味成分類別種數(shù)和種類相對(duì)含量Fig.6 The varieties and relative contents of volatile flavor components in different groups

優(yōu)選菌劑發(fā)酵和自然發(fā)酵搓菜中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類有部分相似，但含量有差別。優(yōu)選菌劑發(fā)酵和自然發(fā)酵搓菜中分別檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)71種和53種。酯類物質(zhì)是發(fā)酵蔬菜中最重要的一類風(fēng)味物質(zhì)，即使在低濃度下也能散發(fā)花香、水果味和蜂蜜味[20]，自然發(fā)酵搓菜中含量最高的是硫氰酸香茅酯(2.15%)，而優(yōu)選菌劑發(fā)酵搓菜中異硫氰酸丁酯(4%)、甲酸反式-4-甲基環(huán)己酯(4.25%)十二內(nèi)酯(5.32%)含量都相對(duì)較高。其中的異硫氰酸酯不僅是發(fā)酵蔬菜重要的特征性風(fēng)味物質(zhì)，同時(shí)也具有抗癌作用[21]。酯類物質(zhì)在優(yōu)選菌劑發(fā)酵組中的種類數(shù)和相對(duì)含量都比自然發(fā)酵組高，且是優(yōu)選菌劑發(fā)酵組中含量及種類最豐富的一類物質(zhì)，這與侯愛香等[22]研究結(jié)果一致。這種差異可能是由于自然發(fā)酵中有效微生物含量較少，發(fā)酵啟動(dòng)較慢，代謝產(chǎn)物相互作用產(chǎn)生酯類物質(zhì)較少。

優(yōu)選菌劑發(fā)酵過程中醇類相對(duì)含量最高的是具有清甜香氣的苯乙醇，但在自然發(fā)酵中并未檢測(cè)到，此結(jié)果與徐丹萍等[23]研究結(jié)果相似，在自然發(fā)酵泡菜中未檢測(cè)到苯乙醇，但在老泡菜水發(fā)酵泡菜中含量卻較高。優(yōu)選菌劑發(fā)酵醇類物質(zhì)(17.86%)相對(duì)含量高于自然發(fā)酵(12.99%)，可能是由于優(yōu)選菌劑發(fā)酵接種乳酸菌和酵母菌代謝產(chǎn)生大量醇類物質(zhì)，使得優(yōu)選菌劑發(fā)酵搓菜中醇類物質(zhì)較為豐富。酮類和醛類具有較低的氣味閾值和特殊的氣味，醛類具有草本香氣，是氨基酸分解代謝和不飽和脂肪酸自氧化產(chǎn)生的主要物質(zhì)[24]，而酮類化合物具有甘草味，但二者不穩(wěn)定，在發(fā)酵后期可進(jìn)一步反應(yīng)形成酸和醇，優(yōu)選菌劑發(fā)酵組中酮類物質(zhì)的種類數(shù)和相對(duì)含量都較自然發(fā)酵組高，而醛類物質(zhì)與之相反，可能是由于自然發(fā)酵搓菜啟動(dòng)較慢，相同條件下被還原的醛類物質(zhì)相對(duì)較少，因此留在產(chǎn)品中醛類物質(zhì)相對(duì)較多。

酸類、烴類和雜環(huán)類化合物氣味閾值相對(duì)較高，本研究中雜環(huán)類化合物相對(duì)含量較高，尤其是在自然發(fā)酵搓菜中。酸類及烴類物質(zhì)在兩組間含量差異較大，但對(duì)風(fēng)味直接貢獻(xiàn)不大，僅可與其他物質(zhì)相互作用或作為其他風(fēng)味物質(zhì)的前體[25]。

硫化物，芳香類及胺類物質(zhì)在兩組樣品中相對(duì)含量都較低。芳香類中甲苯在自然發(fā)酵中相對(duì)含量較高，但在優(yōu)選菌劑發(fā)酵中較低。硫化物和胺類化合物僅在含量上有差異，硫化物氣味閾值較低，且有強(qiáng)烈的洋蔥氣味，對(duì)發(fā)酵蔬菜的整體嗅覺特性做出了重要貢獻(xiàn)，是發(fā)酵蔬菜中最重要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之一[26]。

從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成看，優(yōu)選菌劑發(fā)酵比自然發(fā)酵物質(zhì)更為豐富，且重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)占比更高，與感官評(píng)定結(jié)果相符。此結(jié)果進(jìn)一步說明使用復(fù)合菌發(fā)酵搓菜可以替代自然發(fā)酵搓菜實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究從江西萍鄉(xiāng)特色自然發(fā)酵搓菜中篩選出7株優(yōu)勢(shì)菌種，通過基礎(chǔ)生理實(shí)驗(yàn)選擇各項(xiàng)生理指標(biāo)都較強(qiáng)的L.buchneri、L.sunkii、L.plantarum、L.brevis、P.kudriavzevii、K.bulderi作為最終的發(fā)酵菌株。經(jīng)菌種內(nèi)最佳配比實(shí)驗(yàn)得到乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2為2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3、2∶3時(shí)分別有相對(duì)較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。在前期研究基礎(chǔ)上以乳酸菌∶酵母菌=1∶3接種發(fā)酵搓菜，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵后搓菜質(zhì)構(gòu)、顏色分析及感官評(píng)定結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母菌Y1∶Y2=1∶2，乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=3∶2(即R1/R4/R5/R2=1∶1∶1∶2)時(shí)發(fā)酵所得搓菜綜合評(píng)價(jià)最好。最后比較自然發(fā)酵與優(yōu)選菌劑發(fā)酵搓菜的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選菌劑發(fā)酵相比于自然發(fā)酵物質(zhì)更為豐富，且重要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)占比更高。此研究結(jié)果可為快速高效的發(fā)酵萍鄉(xiāng)搓菜提供科學(xué)的理論指導(dǎo)。