新疆傳統(tǒng)奶酪中產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的優(yōu)選及酶學(xué)特性研究

李曉楠，李宇輝，盧士玲*，王俊鋼，李寶坤，劉世琳

1(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子，832000)2(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子，832000) 3(新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子，832000)

新疆傳統(tǒng)奶酪也稱(chēng)奶疙瘩，是哈薩克族牧民為解決剩余鮮奶，將牛奶經(jīng)自然發(fā)酵、排乳清制成的奶制品，它基本排除了牛奶中的水分，具有鮮奶10倍的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，有“乳品黃金”之稱(chēng)[1]。

有研究報(bào)道乳酸菌作為奶酪中的發(fā)酵劑已有3 600 年歷史[2]，目前市場(chǎng)中銷(xiāo)售的奶酪在發(fā)酵時(shí)幾乎都使用多種乳酸菌混合發(fā)酵，得到的產(chǎn)品不僅風(fēng)味鮮美獨(dú)特且質(zhì)地細(xì)膩。產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌可對(duì)鮮奶進(jìn)行發(fā)酵，在奶酪的成熟及后熟過(guò)程中分解脂肪從而影響脂肪酸的變化[3]。短中鏈游離脂肪酸由于其較低的閾值對(duì)奶酪風(fēng)味貢獻(xiàn)很大，是多種揮發(fā)性化合物的前體物質(zhì)，在奶酪成熟的各階段產(chǎn)生不同的風(fēng)味[4]。白雪等[5]研究發(fā)現(xiàn)奶貝和酸奶經(jīng)微生物脂肪酶處理后，檢測(cè)到氮氧化合物、硫化物、芳香成分和有機(jī)硫化物等含量均有增加，醛類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、酮類(lèi)化合物相對(duì)含量比未添加脂肪酶樣品的相對(duì)含量高。何捷等[6]從新疆牧區(qū)酸馬奶中篩選出1株產(chǎn)脂肪酶植物乳桿菌，其酶活力為8.54 U/mL。2019年景智波[7]從53株乳酸菌中篩選出1株高產(chǎn)脂肪酶的瑞士乳桿菌，最適反應(yīng)溫度為35 ℃，屬于中度耐熱溫和型脂肪酶，將其應(yīng)用于發(fā)酵羊肉香腸中，能夠顯著促進(jìn)游離脂肪酸的釋放，改變了香腸中脂肪酸組分并提升風(fēng)味，同時(shí)產(chǎn)酸性能較好，能快速降低水分活度、pH，抑制雜菌生長(zhǎng)。

本文利用三丁酸甘油酯平板透明圈法結(jié)合銅皂法測(cè)酶活力，從傳統(tǒng)奶酪中篩選高產(chǎn)脂肪酶的乳酸菌，對(duì)其產(chǎn)酶特性及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步研究，為后續(xù)作為發(fā)酵劑在奶酪制品中的使用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為新疆傳統(tǒng)乳制品的現(xiàn)代化生產(chǎn)以及品質(zhì)提升提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、培養(yǎng)基

1.1.1 原料

奶酪樣品來(lái)自伊犁地區(qū)、哈密地區(qū)、塔城地區(qū)。

1.1.2 試劑

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)-124、無(wú)水Na2CO3，西隴科學(xué)有限公司；橄欖油，嘉里糧油(天津)有限公司；無(wú)水乙醇，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三丁酸甘油酯、TritionX-100，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；甲苯、冰乙酸，天津市鑫鉑特化工有限公司；1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，索萊寶(北京)科技有限公司；Tween 80、Tween 20，福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑的配制

富集培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二胺2 g，吐溫80 1 mL，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min；種子培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，氯化鈉3 g，葡萄糖5 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，蒸餾水1 L，121 ℃滅菌20 min；分離培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基1 L、瓊脂20 g；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：硫酸銨1 g、硫酸鎂1 g、橄欖油乳化液12 mL、蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、磷酸氫二鉀1 g、蒸餾水1 L；初篩培養(yǎng)基：三丁酸甘油酯乳化液20 mL、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液980 mL、瓊脂20 g。

橄欖油乳化液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取PVA-124 3.0 g，加入150 mL蒸餾水，室溫溶脹30 min后于95 ℃水浴溶解30 min至溶液透明后冷卻至室溫，加入橄欖油50 mL，用高速組織分散器處理20 min至混合液為乳白色的均勻乳化液，現(xiàn)配現(xiàn)用；三丁酸甘油酯乳化液的配制：用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的PVA溶液配制2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三丁酸甘油酯乳化液。

1.2 儀器與設(shè)備

22331 高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf AG公司；核酸測(cè)定儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；HP1020凝膠成像系統(tǒng)、T100 RCE儀，美國(guó)Bio-Rad公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡，奧林巴斯(廣州)工業(yè)有限公司；EONC酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；UB-7 pH計(jì)，美國(guó)賽多利斯斯丹福公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的分離篩選及鑒定

1.3.1.1 樣品乳酸菌的分離

參照Z(yǔ)HENG等[8]的實(shí)驗(yàn)方法。將奶酪樣品在無(wú)菌條件下用研缽研碎并充分混勻，取10 g于100 mL富集培養(yǎng)基中37 ℃，150 r/min搖床富集24 h。吸取1 mL富集后菌液于9 mL無(wú)菌生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)埔簶屛?0-4、10-5、10-6梯度200 μL菌液于MRS瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取疑似乳酸菌且形態(tài)不同的單菌落多次平板劃線(xiàn)，至顯微鏡觀(guān)察為純種菌落，進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，將革蘭氏染色呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶呈陰性菌株暫定為乳酸菌，并進(jìn)行菌落及細(xì)胞形態(tài)的記錄，用50%(體積分?jǐn)?shù))的甘油溶液于-80 ℃冰箱保藏備用。

1.3.1.2 高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的初篩

參照ESTEBAN-TORRES等[9]的實(shí)驗(yàn)方法并做適當(dāng)修改。將樣品中篩選出暫定為乳酸菌的菌株于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，移液槍吸取100 μL菌液注入三丁酸甘油酯瓊脂培養(yǎng)基上的牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀(guān)察是否具有透明圈并記錄直徑，選擇透明圈直徑較大的菌株進(jìn)行生物學(xué)鑒定及復(fù)篩。

1.3.1.3 高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌生物學(xué)鑒定

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取菌株DNA，并檢測(cè)其純度，以便后續(xù)使用。

PCR擴(kuò)增引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)；擴(kuò)增體系(50 μL)為2×Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)34次，最后72 ℃ 延伸10 min。

由上海生工生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast序列同源性比對(duì)，用MAGE 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.1.4 高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的復(fù)篩

參考江慧芳等[10]的方法并做適當(dāng)修改。將初篩得到的產(chǎn)生透明圈較大且16S rDNA鑒定為乳酸菌的菌株進(jìn)行脂肪酶活力測(cè)定。脂肪酶活性單位定義：37 ℃中1 mL酶液1 min水解橄欖油生成1 μmol脂肪酸為1個(gè)酶活單位。

1.3.1.5 粗酶液的制備

將篩出的產(chǎn)酶優(yōu)良的乳酸菌接種于10 mL種子培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量接種至10 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h得到發(fā)酵液，參照董娟[11]的方法對(duì)粗酶液進(jìn)行提取。

1.3.1.6 脂肪酶活力的測(cè)定

使用脂肪酶活性檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)測(cè)定脂肪酶活力。計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：T，催化反應(yīng)時(shí)間；m，發(fā)酵液稀釋倍數(shù)。

1.3.2 高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌產(chǎn)酶特性研究

1.3.2.1 培養(yǎng)時(shí)間及溫度對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

將目標(biāo)菌接種于10 mL 種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于不同溫度(25、30、35、37、40、45 ℃)下180 r/min搖床培養(yǎng)，每12 h于710 nm處測(cè)定吸光值，每組測(cè)3個(gè)平行取平均值。

1.3.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

參考劉延波等[12]的方法做少量修改。將目標(biāo)菌接種于10 mL 種子培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在37 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)定酶活力，每組測(cè)3個(gè)平行。

1.3.2.3 接種量對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

參考胡珺等[13]的實(shí)驗(yàn)方法并做適當(dāng)修改。將目標(biāo)菌接種在種子培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，分別按0.5%、1%、2%、4%、6%的接種量在50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)酶活力。

1.3.2.4 不同表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

參考ZHANG等[14]的方法并做少量修改。將乳酸菌接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至分別添加10%(體積分?jǐn)?shù))Tween 80、Tween 20、Trition X-100、PVA的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不添加表面活性劑的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，將最高酶活記為100%，在37 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)算每組相對(duì)酶活，每組測(cè)3個(gè)平行。

1.3.3 脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.3.3.1 不同溫度對(duì)脂肪酶的影響

將制備好的酶液分別在10～60 ℃下保溫20 min后測(cè)定酶活力，每個(gè)溫度測(cè)3個(gè)平行。

1.3.3.2 pH值對(duì)脂肪酶的影響

參照TURATI等[15]的方法并做適當(dāng)修改。將酶液pH值調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在最適條件下保溫30 min后測(cè)定酶活力，每組測(cè)3個(gè)平行。

1.3.3.3 不同金屬離子和抑制劑對(duì)脂肪酶的影響

在制備好的酶液中分別加入5和10 mmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、EDTA，在最適條件下保溫20 min后測(cè)定酶活力，將未添加金屬離子的酶液活力記為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力以確定不同金屬離子及抑制劑對(duì)脂肪酶活力的影響。

1.4 數(shù)據(jù)與處理

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0分析，用Origin 8.5作圖，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行且測(cè)定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式，數(shù)據(jù)分析當(dāng)P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的篩選

目前，已有報(bào)道從土壤、污水、食堂廢棄物等環(huán)境中分離產(chǎn)脂肪酶的霉菌[16-17]，而對(duì)來(lái)自食品中乳酸菌產(chǎn)脂肪酶的研究并不多。本實(shí)驗(yàn)從奶酪樣品中分離到282株純培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭氏染色、酶觸實(shí)驗(yàn)將267株暫定為乳酸菌。初篩有35株菌產(chǎn)生明顯透明圈，其中T1-3、T1-5、B2-5產(chǎn)透明圈較大，直徑最大為15.6 mm。具體結(jié)果如表1。

表1 產(chǎn)脂肪乳酸菌篩選結(jié)果Table 1 Screening results of fat producing lactic acid bacteria

根據(jù)脂肪酶標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作方法，得出油酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=0.007 8x+0.012 1，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，線(xiàn)性關(guān)系較好。利用銅皂法對(duì)初篩的35株菌進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果顯示B2-5、T5-16、H1-6具有較高的酶活力。綜合初篩和復(fù)篩結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇T1-3、T1-5、H1-6、B2-5進(jìn)行產(chǎn)酶特性及酶學(xué)性質(zhì)的研究。

2.2 乳酸菌的鑒定

將篩選出的35株產(chǎn)透明圈較大菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定，確定35株均為乳酸菌。結(jié)合透明圈直徑和酶活確定T1-3、T1-5、H1-6、B2-5產(chǎn)脂肪酶較好，菌落形態(tài)及革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。通過(guò)16S rDNA基因檢測(cè)分析，B2-5與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高(100%)；T1-5和T1-3與融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)同源性最高(100%)；H1-6與瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)具有100%同源性。

目前用于奶酪發(fā)酵的乳酸菌多為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、瑞士乳桿菌等，魏斯氏菌是發(fā)酵豆制品、發(fā)酵肉制品中常見(jiàn)的乳酸菌，而其作為乳品中產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的研究鮮有報(bào)道[18]。有研究表明[19]魏斯氏菌具有一定的耐人工腸液和降膽固醇的益生特性，且具有較好的耐酸耐膽堿鹽性質(zhì)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌有明顯抑制效果。

a-菌落形態(tài)；b-革蘭氏染色后細(xì)胞形態(tài)圖1 高產(chǎn)脂肪酶菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of the high-producing lipase strain

2.3 產(chǎn)脂肪酶乳酸菌的產(chǎn)酶特性分析

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

溫度是微生物生長(zhǎng)代謝的重要影響因素之一，圖2顯示隨著溫度的上升，菌株產(chǎn)酶能力逐漸增強(qiáng)，B2-5 和H1-6在37 ℃產(chǎn)生脂肪酶活力最高，T1-3和T1-5在35 ℃產(chǎn)酶效果最好。之后隨著溫度的上升產(chǎn)酶活力均有所下降，B2-5產(chǎn)酶能力受溫度影響較大，但較其他3株菌產(chǎn)酶活力高，最適溫度可達(dá)3.85 U/mL。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.2 Influence of culture temperature on lipase production by strains

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

圖3為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為36 h時(shí)，H1-6、B2-5產(chǎn)酶活力最高，分別為2.65、4.26 U/mL，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)酵液酶活力明顯下降(P<0.05)，發(fā)酵72 h菌株B2-5的酶活力僅為最高點(diǎn)的42.78%；T1-5、T1-3在發(fā)酵48 h達(dá)到最大酶活力分別為1.98、2.02 U/mL，隨后緩慢下降至 1.27 U/mL 左右。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.3 Influence of culture time on lipase production by strains

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

4株乳酸菌的產(chǎn)酶能力隨發(fā)酵液初始pH的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)(圖4)，當(dāng)初始pH=7時(shí)，T1-3和B2-5產(chǎn)酶活力最高，B2-5酶活力可達(dá)4.02 U/mL；當(dāng)pH>7時(shí)，酶活力大幅下降(P<0.05)，因此中性環(huán)境更適合T1-3、B2-5發(fā)酵產(chǎn)酶。發(fā)酵液初始pH值為6時(shí)，菌株T1-5和H1-6達(dá)到最大酶活力，此時(shí)酶活力分別為2.81、2.48 U/mL，之后隨著pH值的增大，產(chǎn)酶效果迅速下降。景智波等[20]研究在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6時(shí)，目標(biāo)乳酸菌具有最大酶活，這與本研究結(jié)果較為相似。

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.4 Effect of the initial pH on lipase production by the strain

2.3.4 不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

微生物接種量適宜有利于在較短發(fā)酵時(shí)間內(nèi)獲得足夠的菌體量，利于產(chǎn)酶，如果接種量過(guò)少，菌體生物量增長(zhǎng)緩慢，則會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期；反之又會(huì)導(dǎo)致菌體增長(zhǎng)過(guò)快，代謝產(chǎn)物增多，培養(yǎng)基黏度增大，致使溶氧不足等問(wèn)題，不利于產(chǎn)酶[11]。本實(shí)驗(yàn)中4株乳酸菌產(chǎn)酶受接種量的影響見(jiàn)圖5，當(dāng)接種量為4%，B2-5產(chǎn)酶活力最高；接種量為2%，T1-3、T1-5和H1-6產(chǎn)生的酶活力可達(dá)最大值，證明該接種量最利于菌株產(chǎn)酶，這與張晶晶等[21]研究結(jié)果比較相似。

圖5 不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.5 Effect of different inoculum on lipase production by strains

2.3.5 不同表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響

不同表面活性劑對(duì)4株產(chǎn)酶乳酸菌的影響如圖6所示，在添加PVA后菌株產(chǎn)酶活力均提高了30%～40%不等，確定PVA為最佳表面活性劑。與對(duì)照組相比，Tween 80、Tween 20、Triton X-100的添加對(duì)4株乳酸菌產(chǎn)酶能力均有不同程度的抑制作用，Tween 80的抑制作用最明顯，其次是Triton X-100，這與CORZO等[22]的研究結(jié)果較不同，可能是由產(chǎn)酶菌株不同而導(dǎo)致的。

圖6 不同表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶的影響Fig.6 Effects of different surfactants on lipase production by strains

2.4 菌株脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對(duì)脂肪酶活力的影響

4株乳酸菌所產(chǎn)脂肪酶活力分別在35、40 ℃達(dá)到了峰值(圖7)，B2-5的脂肪酶活力在40 ℃約為5.02 U/mL；菌株T1-5、H1-6、T1-3的酶活力與各自最低點(diǎn)相比分別提高了約145%、126%和146%，當(dāng)環(huán)境溫度高于最適溫度時(shí)，酶活力大幅度下降(P<0.05)。張傳麗等[23]相關(guān)研究中得到脂肪酶最適催化溫度為50 ℃，當(dāng)溫度升高至90 ℃時(shí)，酶活力僅為最高點(diǎn)的20%，這一變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果相似。綜上所述，4株乳酸菌所產(chǎn)的脂肪酶均屬于中溫脂肪酶。

圖7 溫度對(duì)脂肪酶活性的影響Fig.7 Effect of temperature on lipase activity

2.4.2 不同pH值對(duì)脂肪酶活力的影響

乳酸菌的大量繁殖會(huì)使環(huán)境pH降低，因此確定脂肪酶的耐酸性十分重要[24]。由圖8可知，菌株H1-6和B2-5的脂肪酶在pH值為6時(shí)活力最高，分別為3.12、4.89 U/mL；當(dāng)pH>6時(shí)酶活力迅速下降(P<0.05)。融合魏斯氏菌T1-3和T1-5的脂肪酶最適作用pH值為5；環(huán)境pH>5時(shí)酶活力明顯受到抑制。而郭冉冉[25]在酶學(xué)性質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶菌株酶活力隨pH增大逐漸上升，在pH=9.0達(dá)到極值，這可能是樣品來(lái)源、產(chǎn)酶菌株不同導(dǎo)致脂肪酶之間存在差異?？傮w來(lái)看4株乳酸菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶在酸性環(huán)境下均有良好的酶活力，具備較好的耐酸能力，屬于酸性脂肪酶。

圖8 不同pH值對(duì)脂肪酶活性的影響Fig.8 Effect of different pH on lipase activity

2.4.3 不同金屬離子及抑制劑對(duì)脂肪酶活力的影響

食品中通常會(huì)由于生產(chǎn)加工或自身因素而含有一些金屬離子，如肉制品加工過(guò)程中會(huì)使用含Na+、K+、Mg2+的鹽，牛乳中富含K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Na+，且會(huì)因氣候、飼料、動(dòng)物健康情況發(fā)生變化[26]。因此本實(shí)驗(yàn)將5、10 mmol/L的不同金屬離子及EDTA抑制劑添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，由表2和表3可知，K+、Na+、Fe2+、Mn2+對(duì)4株乳酸菌脂肪酶均有明顯促進(jìn)作用(P<0.05)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)e2+和K+顯著提高2株融合魏斯氏菌的酶活力(P<0.05)，在5 mmol/L Na+、Mn2+存在的情況下， B2-5脂肪酶活力分別提高了約15%和17%，將離子濃度升高為10 mmol/L時(shí)，酶活力繼續(xù)提高；同樣地，5 mmol/L的Mn2+使H1-6的酶活力提高了約22%；Mn2+也可刺激T1-3和T1-5的脂肪酶活力有所提升，TURATI等[15]研究表明Mn2+不僅可以顯著提高脂肪酶活力，還能夠獲得較高的穩(wěn)定性。

表2 5 mmol/L不同金屬離子及抑制劑對(duì)脂肪酶活力的影響Table 2 Effects of 5 mmol/L different metal ions and inhibitors on lipase activity

表3 10 mmol/L不同金屬離子及抑制劑對(duì)脂肪酶活性的影響Table 3 Effects of 10 mmol/L different metal ions and inhibitors on lipase activity

相反，與對(duì)照組相比，Cu2+、Al3+、Fe3+和EDTA的存在對(duì)脂肪酶活力有著不同程度的顯著抑制作用(P<0.05)，10 mmol/L Al3+可抑制B2-5脂肪酶約65%的活性；Cu2+無(wú)論濃度高低均能抑制H1-6約50%的酶活，這與周晶[27]的研究結(jié)果相似；Ca2+和Mg2+的存在對(duì)脂肪酶活力影響較??；KRETZA等[28]研究發(fā)現(xiàn)Zn2+對(duì)脂肪酶活力有輕微抑制作用，與本文結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合三丁酸甘油酯平板法和銅皂法從267株乳酸菌中篩選出4株高產(chǎn)脂肪酶乳酸菌，分別為B2-5(L.plantarum)、T1-5(W.confusa)、T1-3(W.confusa)、H1-6(L.helveticus)。

結(jié)果表明PVA是促進(jìn)4株乳酸菌產(chǎn)脂肪酶的最佳表面活性劑，在35～40 ℃的中酸性初始培養(yǎng)基中產(chǎn)酶效果最好。接種量對(duì)乳酸菌產(chǎn)酶影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為4%時(shí)，B2-5產(chǎn)生的酶活力最高；接種量為2%時(shí)，T1-3和T1-5、H1-6的酶活力可達(dá)峰值。

在酶學(xué)特性分析實(shí)驗(yàn)中，35～40 ℃為脂肪酶最適催化環(huán)境，4株乳酸菌所產(chǎn)脂肪酶均為酸性脂肪酶，K+、Na+、Fe2+、Mn2+的存在對(duì)脂肪酶活力有明顯提升(P<0.05)，而Cu2+、Al3+能明顯抑制其活力。

總體來(lái)看，W.confuseT1-3和T1-5對(duì)產(chǎn)酶環(huán)境的耐受性較好，L.plantarumB2-5在37 ℃，以2%的接種量于初始pH值為7且添加了PVA為表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后，產(chǎn)生的脂肪酶活力可達(dá)5.29 U/mL，產(chǎn)脂肪酶能力最強(qiáng)。滿(mǎn)麗莉等[29]從內(nèi)蒙古酸馬奶中分離出的L.plantarumMXG-68對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率高達(dá)64%，且對(duì)多種抗菌藥物均表現(xiàn)敏感性，能夠耐受極端環(huán)境壓力、抑制腸道致病菌。因此植物乳桿菌和融合魏斯氏菌可作為發(fā)酵乳品中潛在益生菌，應(yīng)用前景廣闊。