山東省某規(guī)模化豬場豬胸膜肺炎綜合診斷

劉奎昊，李焱，李超，趙君，孟凡亮，劉思當*，李寧

山東省某規(guī)?；i場豬胸膜肺炎綜合診斷

劉奎昊1?，李焱1?，李超2，趙君1，孟凡亮1，劉思當1*，李寧1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗/山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018；2.山東省夏津縣行政審批服務局，山東 夏津）

本研究對泰安某規(guī)模化豬場育肥豬的病死豬進行了病理剖檢觀察、病理組織學檢查和病原檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病豬心包擴張，腔內(nèi)充滿漿液纖維素性滲出物，肺胸膜表面有纖維素滲出，肺膈葉暗紅色實變，病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)肺呈卡他性纖維素性出血性肺炎病變，肺組織內(nèi)可見藍染球桿菌。PCR檢測僅豬胸膜肺炎放線桿菌呈陽性，通過細菌分離和16S rDNA測序進一步證實該菌為豬胸膜肺炎放線桿菌，遺傳進化分析顯示其與目前我國豬場中流行的豬胸膜肺炎放線桿菌株的遺傳關(guān)系較近，未見明顯變異。

豬傳染性胸膜肺炎；放線桿菌；分離鑒定；遺傳變異

豬傳染性胸膜肺炎（porcine infectious pleuro-pneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（APP）引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，對養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟損失。各年齡段、性別的豬對APP均易感，但以3月齡左右的育肥豬發(fā)病率較高。豬感染APP后主要表現(xiàn)為高熱、呼吸困難、咳嗽、拒食和突然死亡。病死豬剖檢病變主要局限于胸腔，可見特征性的纖維素性、壞死性和出血性肺炎以及纖維素性胸膜炎[1]。

我國1987年首次發(fā)現(xiàn)APP。該菌血清型眾多，在我國流行較為復雜。2018年，新疆地區(qū)暴發(fā)了以血清5型為主的豬傳染性胸膜肺炎[2]。近期，河南省洛陽市出現(xiàn)以血清5型為主的豬傳染性胸膜肺炎[3]，皖西地區(qū)某規(guī)?；i場分離的菌株則是血清7型[4]。整體上，我國主要以血清1、2、3、5和7型流行較為普遍[5]。

近期，山東省某規(guī)?；i場暴發(fā)呼吸道疾病，病死率較高。為確診該病，對該豬場發(fā)病豬進行了常規(guī)病理剖檢、常見病原的PCR檢測，以及細菌分離鑒定和測序分析，最終鑒定引起該豬場疫情的病原為APP。本次診斷對豬傳染性胸膜肺炎的診斷和防治有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試驗材料 核酸提取試劑盒（Easypure Viral DNA/RNA Kit）、克隆試劑盒（pEASY-T1 Simlie）均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒（Biospin Gel Extraction Kit）購自杭州博日科技有限公司；瓊脂糖粉購自Sigma公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、血瓊脂培養(yǎng)基、普通酶、DL 2 000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 發(fā)病情況 2019年3月，山東省某規(guī)?；i場90 kg左右的育肥豬出現(xiàn)精神沉郁、體溫上升、咳嗽、氣喘、呼吸困難和耳朵發(fā)紫等癥狀，發(fā)病嚴重豬出現(xiàn)死亡。該養(yǎng)殖場共有商品肉豬2 000頭，發(fā)病率為約10 %，83頭發(fā)病嚴重的豬死亡。

1.2 方法

1.2.1 病理剖檢及組織病理學檢測 對病死豬進行病理剖檢，觀察記錄病豬各臟器病理變化。采取病豬的肺、脾和腎等組織樣品，于10 % 福爾馬林溶液固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)HE染色后鏡檢組織病理學變化。

1.2.2 細菌分離鑒定 使用高溫滅菌接種環(huán)，對病豬肺組織進行無菌取樣；樣品接種于含有NAD的血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察生長情況；挑取單菌落置于載玻片上，用50ml無菌PBS均勻涂抹，革蘭染色后鏡檢觀察細菌染色及形態(tài)特征。

1.2.3 PCR檢測 （1）將采集的病豬組織樣品剪碎后加入適量滅菌PBS研磨勻漿，置于 ? 80 ℃ 反復凍融3次后，4 ℃ 9 000 r/min離心3 min，取上清提取核酸并將其作為模板對臨床常見病原進行PCR檢測，包括豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respire-tory syndrome virus，PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）、副豬嗜血桿菌（Hps）和APP，以及APP的毒素基因。細菌16S rDNA通用引物為27F/1492R。以上引物均為本實驗室保存，具體序列見表1。（2）將提取的核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用檢測引物進行擴增。PCR擴增體系25 μl：2×Plus Master MixⅡ（Dye Plus）12.5ml，上下游引物各1ml，模板3 μl，ddH2O 7.5ml。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30～90 s，共32個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到目的片段進行T-A克隆，陽性菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。從GenBank中下載7株APP序列（KR071801、AB635380.1、AF033058.1、AF033060.1、KX579946、M75074.1和NR-044752.2），2株沙門氏菌（）序列（KY776577和MT500568.1），通過MEGA6軟件中的Maximum Likehood tree方法進行該分離菌株的遺傳進化分析，同時使用MegAlign軟件進行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理及病理組織學檢測結(jié)果 剖檢病死豬可見肺出血，肺表面有纖維素滲出，肺和胸膜壁層粘連。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)：肺泡腔內(nèi)有大量的紅細胞和漿液纖維素滲出；肺泡壁增厚，間質(zhì)有紅細胞和炎性細胞浸潤；支氣管腔內(nèi)可見脫落的黏膜上皮細胞，肺泡壁和肺泡腔內(nèi)有藍染球桿狀細菌，并見充血出血和纖維素滲出。結(jié)果表明，該豬場豬群發(fā)病可能由細菌引起。

2.2 分離的細菌 將病死豬肺組織樣品接種含有NAD的血瓊脂培養(yǎng)基24 h后，可見直徑約1 mm左右表面光滑、圓形、邊緣整齊、針尖大小的菌落，在菌落周邊出現(xiàn)溶血環(huán)現(xiàn)象，在油鏡下可見革蘭氏紅染的球桿菌。初步推斷，該分離菌為APP。

表1 試驗中所用檢測引物信息

圖1 常見病原及毒力基因ApxIV的PCR檢測結(jié)果

A. 常見病原檢測；B. 毒力基因檢測；M. DNA Marker；+. 陽性對照；–. 陰性對照；1. 檢測樣品。

2.3 PCR檢測結(jié)果 以發(fā)病豬的肺組織樣品為模板進行常見病原的PCR檢測。在該發(fā)病豬場32份樣品中，共有28份檢測到345 bp的目的條帶，陽性率為87.5 %，CSFV、PRRSV、PRV、PCV-2和Hps均為陰性，僅APP為陽性（圖1-A），APP的毒力基因也為陽性（圖1-B），從而證實該菌為APP。

2.4 分離菌株遺傳進化分析 進一步將APP分離株（SD20191）進行16S rDNA擴增測序，通過MEGA進行遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，該分離菌與其他豬胸膜肺炎放線桿菌分離株（包括KR071801、AB635380.、AF033058.1和AF033060.1）在同一個分支（圖2），核苷酸同源性為100 %（圖3）。

圖2 分離菌株的遺傳進化分析結(jié)果

3 討論

豬傳染性胸膜肺炎是由APP引起的一種急性傳染性呼吸道疾病，其對豬有高度的宿主特異性，主要經(jīng)空氣和接觸傳播。APP專性寄生于宿主呼吸道，急性感染時可存在于肺部、血液和鼻液中[6]。該病在3～5月和9～11月多發(fā)，有明顯的季節(jié)性流行規(guī)律，且易造成保育豬和育肥豬生長障礙或死亡[7]。

在本研究中，發(fā)病豬場90 kg左右的育肥豬出現(xiàn)發(fā)燒、咳嗽癥狀，發(fā)病率約為40 %。首先通過病死豬病理剖檢，觀察到肺表面有大量纖維素性滲出物，并與胸膜粘連，通過組織病理學檢測，可見肺組織有明顯的出血性卡他性炎癥，而且在肺泡腔及其間質(zhì)內(nèi)有大量藍染球桿菌，初步懷疑該病為豬傳染性胸膜肺炎。在此基礎(chǔ)上，通過PCR檢測臨床常見病原，僅檢測出APP，排除了其他病原的感染。APP的外毒素（Apx）在細菌感染和致病過程中具有重要作用，其包括4個亞型：ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV[8]。其中，ApxIV能在感染豬體內(nèi)產(chǎn)生并且具有種屬特異性。該毒素基因常被作為臨床診斷APP的特異性基因。通過PCR檢測，在病死豬肺組織樣品中檢測到，進一步表明病死豬感染了APP。

然后，通過細菌分離鑒定和16S rDNA測序等一系列實驗室方法，進一步確定了引起該豬場疫情的病原為APP。由于APP的血清型眾多，該分離菌株的血清型尚未確定。遺傳進化分析顯示，本研究中獲得的APP分離株與當前我國豬場主要的流行菌株相一致，如KR071801是2015年在我國江西省分離的[9]。

本研究對該豬場暴發(fā)的豬傳染性胸膜肺炎進行了較為系統(tǒng)的診斷，可為該病的診斷和防控提供一定幫助。

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?共同第一作者

（2021–01–25）

S858.28

A

1007-1733（2021）05-0005-03