紅景天苷改善馬拉松業(yè)余選手氧化應(yīng)激損傷引起的代謝通路改變的研究

賈 怡，劉相玉，田俊生，向 歡，秦雪梅，陳安平，韓雨梅*

1山西大學(xué)體育學(xué)院；2山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原 030006

近年來全民健身熱潮日益高漲，國內(nèi)馬拉松賽事舉辦和參賽人數(shù)均呈井噴態(tài)勢，2019年在全國范圍內(nèi)共舉辦規(guī)模賽事1 828場，較2018年同比增長15.62%；累計(jì)參賽人次712.56萬，較2018年同比增長22.22%。馬拉松已經(jīng)發(fā)展成為中國最受歡迎，最具影響力的品牌賽事之一[1]。作為經(jīng)典的有氧耐力運(yùn)動(dòng)，長期馬拉松鍛煉能夠降低人體心血管患病風(fēng)險(xiǎn)和死亡率。然而，由于長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，馬拉松運(yùn)動(dòng)員也可能會(huì)伴隨心臟和腎臟等損傷[2]，其中氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致其損傷的機(jī)制之一。

機(jī)體在劇烈運(yùn)動(dòng)過程中，體內(nèi)可產(chǎn)生和蓄積大量的活性自由基，當(dāng)超出機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時(shí)，即可造成運(yùn)動(dòng)氧化應(yīng)激損傷。中藥紅景天乃景天科紅景屬多年生草本或亞灌木，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《月王藥診》中記載景天性平，有輕身、扶正固本、理氣養(yǎng)血、潤肺補(bǔ)腎、健腦益智、滋補(bǔ)強(qiáng)身之功效；紅景天的有效成分為紅景天苷，其具有抗缺氧、抗自由基、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)，加速機(jī)體有氧代謝供能，增強(qiáng)心肺功能，改善運(yùn)動(dòng)疲勞的積極作用[3]，但其在馬拉松項(xiàng)目中的應(yīng)用研究卻未見報(bào)道。因此，研究紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體代謝能力的影響及作用機(jī)制，對(duì)提高其身體機(jī)能，降低運(yùn)動(dòng)損傷，改善運(yùn)動(dòng)疲勞具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

代謝組學(xué)技術(shù)是運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)研究的新興工具，已經(jīng)逐步應(yīng)用到運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練實(shí)踐和運(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn)的機(jī)制研究中[4]，該技術(shù)通過研究機(jī)體受到外界刺激時(shí)所引起的內(nèi)源性代謝物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合精確的現(xiàn)代分析方法，借助多元統(tǒng)計(jì)分析可辯識(shí)和解析研究對(duì)象的生理、病理狀態(tài)及其環(huán)境等因素與代謝物變化之間的關(guān)系，在表型，毒理學(xué)，疾病相關(guān)生物標(biāo)志物和分子機(jī)制的研究中被廣泛使用，在對(duì)中藥的多組分、多靶點(diǎn)整體藥效評(píng)價(jià)以及機(jī)制研究方面具有明顯優(yōu)勢[5]。

本研究旨在明確補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體氧化應(yīng)激和心肌損傷的影響，并利用代謝組學(xué)技術(shù)闡釋其可能的作用機(jī)制。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取參加5次以上國際馬拉松賽全程組別的男性業(yè)余選手共8名，受試者身體健康，無任何不良的飲食偏好。個(gè)人馬拉松平均成績4～5 h，月跑量200～300km，所有受試者均自愿參加并簽署知情同意書?；厩闆r如表1所示。

表1 受試者基本情況Table 1 Basic situation of the = 8)

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動(dòng)方案

根據(jù)受試者不同階段進(jìn)行分組，分為安靜組(C組)、定量負(fù)荷組(CE組)、服藥后安靜組(MC組)與服藥后定量負(fù)荷組(ME組)。受試者統(tǒng)一進(jìn)行20km的定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，場地為標(biāo)準(zhǔn)的400 m跑道，共50圈。通過專業(yè)運(yùn)動(dòng)手環(huán)記錄跑步距離，全程平均時(shí)間在1.5～2 h，心率150～170 次/min，運(yùn)動(dòng)中只允許補(bǔ)充純凈水。

1.2.2 藥物干預(yù)

紅景天膠囊(四川省佳匯泰生物科技開發(fā)有限公司，國食健字G20120266)，按照說明書每日1次，每次2粒服用(0.3 g/粒，每100 g含紅景天苷1.26 g)，連續(xù)服用一個(gè)月。干預(yù)期間沒有服用其他藥物，受試者日常訓(xùn)練及三餐攝入均不進(jìn)行干預(yù)。

1.2.3 樣品收集與處理

C組與MC組均采集晨尿和安靜時(shí)空腹血液，CE組與ME組血液在定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后即刻采集，尿液在運(yùn)動(dòng)后半小時(shí)收集。血液取肘靜脈血5 mL，3 500 rpm離心15 min取血清；尿液用10 mL離心管分裝，離心取上清液。分離的體液于-80 ℃保存待測。采樣前一天要求受試者不能攝入高脂肪、高蛋白食物。

1.2.4 血清心肌酶系與自由基指標(biāo)的檢測

使用南京建成生物工程研究所相關(guān)試劑盒，通過酶標(biāo)儀(Tecan公司 200 Pro的多功能酶標(biāo)儀，瑞士公司)對(duì)血清心肌酶系指標(biāo)肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及自由基指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和總抗氧化能力(T-AOC)進(jìn)行測定，測試均嚴(yán)格按說明書的步驟進(jìn)行。

1.2.5 核磁信號(hào)采集及數(shù)據(jù)收集

1.2.5.1 尿樣預(yù)處理

尿樣解凍后取500 μL轉(zhuǎn)至EP管中，加入200 μL D2O(美國諾德，蘭迪斯維爾，美國)配制的PBS磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L Na2HPO4/0.2 mol/L NaH2PO4，81∶19，V/V，pH=7.40)，并加入適量0.15%TSP(三甲基叔丁基酸鈉鹽，美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室公司)作為化學(xué)位移零點(diǎn)的定標(biāo)，4 ℃，離心20 min(13 000 rpm)，最后移取上清液600 μL，置于內(nèi)徑5 mm的核磁管中待測。

1.2.5.2 NMR(布魯克600 MHz的AVANCEⅢ核磁共振檢測儀，德國布魯克公司)檢測條件

采用NOESY脈沖序列進(jìn)行樣本測定，參數(shù)設(shè)置為譜寬8 kHz，混合時(shí)間0.15 s，馳豫延遲320 ms，采樣點(diǎn)數(shù)64 k，累加次數(shù)64。在弛豫延遲期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰，譜儀偏置設(shè)置在水峰位置，自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過傅里葉變換轉(zhuǎn)換為1H NMR圖譜。

1.2.5.3 NMR圖譜處理

尿液1H NMR圖譜均使用MestReNova(Version8.0.1,Mestrelab Research,Santiago de ComPostella,SPain)進(jìn)行基線、相位調(diào)整。以TSP的化學(xué)位移(δ0.0)為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)NMR圖譜進(jìn)行化學(xué)位移校正。以δ0.01為基本單位，對(duì)圖譜中δ0.5～9.0的區(qū)域進(jìn)行分段積分，可以得到與化學(xué)位移值段相對(duì)應(yīng)的積分值。為消除水峰、尿素峰對(duì)分析結(jié)果的影響，將δ4.6～6.2區(qū)間的譜峰強(qiáng)度設(shè)置為零。然后采用歸一化法，消除樣品濃度差異的影響，使數(shù)據(jù)集中在0～1范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后血清心肌酶系的影響

如圖1所示，與C組相比，CE組血清CK、LDH與AST活性顯著升高(P<0.01或P<0.05)，CK-MB活性未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MC組僅有AST活性顯著降低(P<0.01)；與CE組相比，ME組CK、AST活性明顯降低(P<0.05)，LDH和CK-MB均無顯著性差異；與MC組相比，ME組CK、LDH和AST活性均顯著性升高(P<0.01或P<0.05)，CK-MB活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后心肌酶系的影響(n = 8)Fig.1 Effect of Salidroside supplementation on myocardial enzymes after amount-loading of marathon amateurs (n =8 )注：與C組相比，*P<0.05；**P<0.01；與CE組相比，#P<0.05；##P<0.01；與MC組相比，▲P<0.05；▲▲ P<0.01。 Note:Compared with C,*P<0.05; **P<0.01;Compared with CE,#P<0.05;##P<0.01;Compared with MC,▲P<0.05;▲▲P<0.01.

2.2 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后血清自由基指標(biāo)的影響

如圖2所示，與C組相比，CE組血清MDA含量、SOD活性均明顯升高(P<0.05)，MC組MDA，SOD、T-AOC與GSH-PX活性均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與CE組相比，ME組中MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD、T-AOC與GSH-PX活性無明顯變化；與MC組相比，ME組中SOD、T-AOC與GSH-PX活性顯著上升(P<0.01或P<0.05)，MDA含量有上升趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后血液自由基指標(biāo)的影響(n = 8)Fig.2 Effect of Salidroside supplementation on blood free radicals index of amateur athletes after marathon (n =8 )注：與C組相比，*P<0.05；**P<0.01；與CE組相比，#P<0.05；##P<0.01；與MC組相比，▲P<0.05；▲▲P<0.01。Note:Compared with C,*P<0.05;**P<0.01;Compared with CE,#P<0.05;##P<0.01;Compared with MC,▲P<0.05;▲▲P<0.01.

2.3 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后尿液代謝物的影響

2.3.1 圖譜指認(rèn)與分析

馬拉松業(yè)余選手尿液1H NMR典型圖譜見圖3。圖譜處理后，通過分析每個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的化學(xué)位移、偶合常數(shù)及峰形等信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道并使用Chenomx NMR Suite 軟件(Version 7.5，Chenomx IncInc，Edmonton，AB，Canada)以及HMDB(http://www.hmdb.ca/)數(shù)據(jù)庫對(duì)圖譜中的主要化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，得到馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷前后δ1.0～8.5的1H NMR尿液代謝圖譜，共指認(rèn)出28種內(nèi)源性代謝物，主要涉及氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝，其化學(xué)位移及譜峰歸屬見表2。

圖3 馬拉松業(yè)余選手尿液 1H NMR圖譜(n = 8)Fig.3 Marathon amateur urine 1H NMR map (n =8 )

表2 馬拉松業(yè)余選手尿液1H NMR 圖譜中主要代謝物指認(rèn)結(jié)果(n = 8)Table 2 Identification results of major metabolites in urine 1H NMR map of marathon amateurs (n = 8)

2.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

采用有監(jiān)督的PLS-DA(偏最小二乘法判別分析)對(duì)尿樣進(jìn)行1H NMR代謝輪廓分析，結(jié)果如圖4所示，C組與CE組、ME組均沿t[2]軸明顯分開，CE組與ME組各自聚集且沿t[1]軸明顯分開(圖a)。進(jìn)一步對(duì)PLS-DA進(jìn)行模型驗(yàn)證(圖b)，累積的R2和Q2都低于原始值(R2= 0.825，Q2= 0.578)，且Q2在縱軸上的截距為負(fù)值，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的模型未發(fā)生過擬合，PLS-DA模型驗(yàn)證成立。

圖4 馬拉松業(yè)余選手C、CE、ME組的PCA散點(diǎn)圖(a)、PLS-DA得分圖(b)和模型驗(yàn)證圖(c)(n = 6)Fig.4 PCA score plot (a),PLS-DA scores (b) and model validation (c) of the marathon amateur C,CE,and ME groups (n = 6)

2.3.3 補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后尿液潛在生物標(biāo)志物的影響

為了明確補(bǔ)充紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后尿液潛在生物標(biāo)志物的影響，分別對(duì)C組、CE組和ME組尿液1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA分析(圖5)。對(duì)C組和CE組的代謝物峰面積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選VIP > 1且P<0.05的代謝物作為定量負(fù)荷前后的潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)：與C組相比，CE組共發(fā)現(xiàn)纈氨酸、乳酸、2-羥基異丁酸等15個(gè)潛在生物標(biāo)志物，其中纈氨酸、乳酸、2-羥基異丁酸、丙酮酸、3-羥基丁酸、賴氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、丙酮和琥珀酸這10種潛在生物標(biāo)志物顯著增加，甜菜堿、甘油、谷氨酰胺、絲氨酸和肌氨酸這5種潛在生物標(biāo)志物顯著下降。在紅景天苷干預(yù)一個(gè)月后，與CE組相比，ME組尿液中上述15種潛在生物標(biāo)志物有11種向C組狀態(tài)顯著回調(diào)，表明紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后的尿液潛在生物標(biāo)志物有顯著的干預(yù)調(diào)節(jié)作用。采用熱圖分析可以更加直觀地展示紅景天苷干預(yù)作用下的11種尿液潛在生物標(biāo)志物在各組中的變化趨勢(圖6)，顏色越深表明在尿液中含量越高，相反，則含量越低。

圖5 馬拉松業(yè)余選手尿液PLS-DA得分圖和模型驗(yàn)證圖(n = 6)Fig.5 Marathon amateur urine PLS-DA score map and model validation map (n = 6)注：a圖和b圖：C vs CE；c圖和d圖：CE vs ME。Note:Fig.a and b:C vs CE;Fig.c and d:CE vs ME.

表3 尿液1H NMR圖譜中代謝物的相對(duì)峰面積(n = 6)Table 3 Relative peak area of differential metabolites in urine 1H NMR spectra (n = 6)

圖6 紅景天苷干預(yù)下尿液中11種潛在生物標(biāo)志物的熱圖(n = 6)Fig.6 Heat map of 11 differential metabolites in urine under the intervention of salidroside (n = 6)

2.4 代謝通路分析

為了探尋紅景天苷干預(yù)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后潛在生物標(biāo)志物所涉及的代謝途徑，對(duì)紅景天苷干預(yù)后11個(gè)顯著回調(diào)的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行MetPA通路富集分析。將其導(dǎo)入MetPA(MetaboAnalyst 4.0，https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行整合，篩選出紅景天苷干預(yù)下明顯改變的代謝途徑，結(jié)果如圖7所示。其中橫坐標(biāo)Pathway Impact表示其代謝通路的重要性值，縱坐標(biāo)-logP表示代謝通路富集分析的顯著性水平。本次分析中設(shè)定代謝通路的閾值為0.1，當(dāng)代謝通路影響值高于0.1時(shí)，該通路可被視為潛在的靶標(biāo)代謝路徑。分析結(jié)果表明紅景天苷干預(yù)下馬拉松業(yè)余選手體內(nèi)潛在生物標(biāo)志物的變化主要與以下代謝通路相關(guān)性最高(impact>0.1)：(1)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；(2)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；(3)氨?；?tRNA生物合成；(4)甘油脂代謝。

圖7 MetPA通路分析(n = 6)Fig.7 Summary diagram of Pathway analysis with MetPA (n = 6)注：1：甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；2：甘油脂代謝；3：氨?；?tRNA的生物合成；4：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。Note:1:Glycine,serine and threonine metabolism;2:Glycerolipid metabolism;3:Aminoacyl-tRNA biosynthesis;4:Alanine,aspartate and glutamate metabolism.

3 討論

3.1 紅景天苷能夠改善馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后機(jī)體氧化應(yīng)激和心肌損傷

研究表明，長期的馬拉松運(yùn)動(dòng)影響機(jī)體抗氧化能力，運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉疲勞和延遲性肌肉酸痛(DOMS)等負(fù)面效應(yīng)大多是由于組織細(xì)胞過度的氧化應(yīng)激所致[6]。而紅景天苷作為一味傳統(tǒng)中藥，具有抗氧化，抗病毒，抗腫瘤等多種藥理作用。本研究測定了服用紅景天苷前后不同狀態(tài)下馬拉松業(yè)余選手血清中抗氧化酶SOD、T-AOC和GSH-PX活性以及MDA含量的變化，其中MDA作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，大量積聚會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡，是機(jī)體氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物之一[7]。與C組相比，CE組MDA含量顯著升高，表明長時(shí)間定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)造成了馬拉松業(yè)余選手體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平升高，SOD活性顯著增加可能是機(jī)體自我調(diào)節(jié)所致。與CE組相比，ME組血清MDA含量顯著降低，說明紅景天苷可以有效改善馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，而抗氧化酶類活性增加無顯著性可能與服藥時(shí)間長短有關(guān)，另一方面也可能與非酶促抗氧化劑的積極作用有關(guān)。ME組相對(duì)于MC組，血清MDA含量無顯著改變，而SOD、T-AOC和GSH-PX活性均顯著增加，提示補(bǔ)充紅景天苷一段時(shí)間后再進(jìn)行相同定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，可以有效提高機(jī)體抗氧化酶活性，降低氧化應(yīng)激水平。

馬拉松作為一項(xiàng)長時(shí)間大負(fù)荷的耐力運(yùn)動(dòng)，其能夠防治心血管相關(guān)疾病的積極作用已被大眾廣泛認(rèn)可，然而越來越多的研究表明，長期馬拉松運(yùn)動(dòng)使心臟負(fù)荷過大，易導(dǎo)致心肌纖維撕裂，造成微損傷，加之運(yùn)動(dòng)過程中自由基產(chǎn)生增多，機(jī)體氧化損傷加劇，抗氧化能力降低，兩方面因素結(jié)合可能誘發(fā)和增加炎癥反應(yīng)從而造成不利的心肌重塑，進(jìn)而誘發(fā)心源性猝死[8]。紅景天苷對(duì)缺氧/復(fù)氧大鼠原代心肌細(xì)胞有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與改善受損心肌細(xì)胞線粒體功能障礙、穩(wěn)定線粒體動(dòng)力學(xué)平衡有關(guān)[9]。本研究選取能夠診斷心肌損傷的參考指標(biāo)心肌酶系，包括AST、LDH和CK-MB來觀察服用紅景天苷對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷前后心肌損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)CE組血清CK、LDH和AST活性較C組均顯著性升高，提示馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后心肌可能出現(xiàn)一定程度的損傷。補(bǔ)充紅景天苷一個(gè)月后進(jìn)行相同負(fù)荷的定量運(yùn)動(dòng)，與CE組相比，ME組CK、AST活性顯著降低。已知CK是參與ATP-CP供能系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，是評(píng)估肌肉損傷的敏感指標(biāo)。AST活性測定有助于對(duì)心臟病變的診斷，正常情況下AST存在于組織細(xì)胞中，心肌細(xì)胞中含量最高，血清中含量極少，心肌梗塞時(shí)血清中AST活性上升[10]。ME組CK和AST活性顯著降低表明紅景天苷能夠減輕馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后的肌肉損傷，并具有保護(hù)心臟的積極作用。

3.2 紅景天苷可以調(diào)控馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷后尿液代謝組學(xué)特征

本研究采用PLS-DA和多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷前后的尿樣進(jìn)行代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、乳酸、2-羥基異丁酸等15種代謝物可被辨識(shí)為CE組尿液內(nèi)源性差異代謝物。補(bǔ)充紅景天苷一個(gè)月后，ME組尿液中上述11種潛在生物標(biāo)志物發(fā)生明顯回調(diào)，說明紅景天苷補(bǔ)充對(duì)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷過程中的機(jī)體代謝有積極的調(diào)節(jié)作用。

3.2.1 能量代謝

核磁代謝組學(xué)結(jié)果揭示了馬拉松業(yè)余選手在定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中三大供能物質(zhì)(碳水化合物，脂質(zhì)和蛋白質(zhì)途徑)的代謝變化規(guī)律。結(jié)果顯示，CE組尿液乳酸水平比C組顯著上升，表明長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體糖酵解供能增加，尿液中乳酸代謝物增加是機(jī)體消除乳酸的途徑之一。研究表明，長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)中不僅糖代謝十分活躍，同時(shí)氨基酸分解代謝加強(qiáng)，特別是纈氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的氧化加強(qiáng)[11]。CE組尿液中纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸，琥珀酸，賴氨酸水平升高提示長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)中機(jī)體蛋白質(zhì)水解增加提高能量補(bǔ)充以維持血糖穩(wěn)定。丙氨酸上調(diào)，表明定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可能促進(jìn)了丙氨酸-葡萄糖循環(huán)以加速肝臟糖異生[12]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后馬拉松業(yè)余選手脂質(zhì)代謝發(fā)生顯著改變。CE組尿液甘油含量顯著下降，3-羥基丁酸和丙酮明顯增加，表明定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過程中甘油糖異生增加，脂代謝加強(qiáng)，酮體合成增加。

3.2.2 氨基酸代謝

肌氨酸，是一種非蛋白氨基酸，可以在肝臟中由甜菜堿代謝生成，研究表明補(bǔ)充甜菜堿可降低肥胖，并增強(qiáng)肌肉耐力和力量[13]。本研究CE組尿液中肌氨酸與甜菜堿水平均顯著下降，表明馬拉松業(yè)余選手在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)后耐力水平下降，機(jī)體產(chǎn)生一定程度的疲勞。絲氨酸屬于營養(yǎng)非必需氨基酸，對(duì)神經(jīng)酰胺，鞘脂和磷脂酰絲氨酸前體的生物合成至關(guān)重要，補(bǔ)充磷脂酰絲氨酸有助于預(yù)防肌肉酸痛，在自行車，舉重和耐力跑方面均能夠提高機(jī)體能力[14]。據(jù)報(bào)道血漿絲氨酸水平與其他多種氨基酸水平降低是耐力運(yùn)動(dòng)的急性反應(yīng)[15]，本研究CE組尿液中的絲氨酸水平明顯降低，這可能是機(jī)體疲勞的表現(xiàn)之一。谷氨酰胺是骨骼肌和血漿中最豐富的氨基酸，它在調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡以及增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能方面具有重要意義[16]。研究表明，血漿谷氨酰胺降低與過度訓(xùn)練綜合征的免疫抑制有關(guān)[17]。本研究CE組尿液谷氨酰胺水平的降低可能與長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的免疫功能下降有關(guān)。

本研究中補(bǔ)充紅景天苷一個(gè)月后，相對(duì)于CE組，ME組尿液中11種潛在生物標(biāo)志物能夠向正常狀態(tài)顯著回調(diào)，表明紅景天苷能夠?qū)︸R拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷引起的機(jī)體代謝變化具有良好的調(diào)節(jié)作用?；贛etaboanalyst在線MetPA通路分析顯示，上述代謝物主要涉及4條代謝通路：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，氨?；?tRNA生物合成和甘油脂代謝。這些代謝通路主要涉及氨基酸代謝和脂代謝。骨骼肌與肝臟之間的丙氨酸—葡萄糖循環(huán)是運(yùn)動(dòng)時(shí)蛋白質(zhì)參與供能的重要途徑，而天冬氨酸和谷氨酸均可參與細(xì)胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，是連接糖代謝和氨基酸代謝的紐帶。甘氨酸為生糖氨基酸,可以轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A參與TCA循環(huán)為機(jī)體提供能量。研究證實(shí)，甘氨酸可由蘇氨酸(蘇氨酸脫氫酶途徑)、膽堿(肌氨酸合成途徑)和絲氨酸(絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶)途徑合成。Heidari 等人發(fā)現(xiàn)適量補(bǔ)充甘氨酸可減輕線粒體腫脹，減少 ROS 和脂質(zhì)過氧化作用，說明甘氨酸可抑制活性氧(ROS)生成，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[18]。葡萄糖衍生的絲氨酸可以代謝為甘氨酸參與合成谷胱甘肽(GSH)，進(jìn)而有助于維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[19]。本研究中ME組MDA含量顯著低于CE組，提示紅景天苷可能通過調(diào)節(jié)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路正向調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而提高了業(yè)余馬拉松選手運(yùn)動(dòng)過程中的抗氧化能力。甘油脂代謝是指甘油三酸酯被分解產(chǎn)生甘油和脂肪酸的過程。甘油可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磷酸二羥丙酮參與糖代謝或糖異生，而脂肪酸通過β氧化釋放大量能量供人體活動(dòng)需要。本研究中CE組較C組甘油含量顯著下降，說明業(yè)余馬拉松選手運(yùn)動(dòng)過程中脂肪分解代謝活躍，糖異生作用加強(qiáng)，補(bǔ)充紅景天苷后ME組尿液甘油含量顯著高于CE組，說明機(jī)體運(yùn)動(dòng)過程中脂肪代謝供能比例增加，產(chǎn)能效率顯著提高。另外，在氨?；?tRNA生物合成代謝通路中，氨?；?tRNA合成酶是核編碼的酶，該氨?；磻?yīng)為蛋白質(zhì)翻譯過程提供了底物，是細(xì)胞質(zhì)與線粒體蛋白翻譯的必需物質(zhì)，在蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[20]。本研究中，紅景天苷干預(yù)后ME組纈氨酸等多種氨基酸代謝產(chǎn)物均發(fā)生回調(diào)，提示可能存在蛋白質(zhì)翻譯過程的變化，進(jìn)而對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。綜上所述，本研究結(jié)果提示：紅景天苷改善馬拉松業(yè)余選手氧化應(yīng)激損傷并不是單一的靶點(diǎn)，可能與機(jī)體內(nèi)多條生理通路有關(guān)。紅景天苷在馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷過程中可能通過促進(jìn)相關(guān)氨基酸和脂質(zhì)代謝，增加脂肪利用率，節(jié)約蛋白質(zhì)，進(jìn)而改善氧化應(yīng)激和心肌損傷。

未來工作中可以進(jìn)一步采用其他代謝組學(xué)方法如質(zhì)譜、色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)展開研究；也可以整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)行深入研究，從而系統(tǒng)全面地闡釋中藥紅景天苷在改善馬拉松業(yè)余選手氧化應(yīng)激損傷中的代謝調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

補(bǔ)充紅景天苷能夠增強(qiáng)馬拉松業(yè)余選手定量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的抗氧化能力，改善心肌損傷，其機(jī)制可能主要是通過促進(jìn)氨?；?tRNA及其他氨基酸的合成和利用而發(fā)揮作用。